DHODH抑制引起黑色素瘤細胞周期阻滯、自噬.pdf

1、目的：惡性黑色素瘤(MM)是起源于神經(jīng)嵴黑色素細胞的高度惡性腫瘤，易轉移，預后差。近年來，我國惡性黑色素瘤發(fā)病率迅速增長。多數(shù)早期患者能夠通過手術得到治愈，但對于中晚期患者，標準化療效果欠佳，因此探索高效低毒的新方法尤為重要。二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)存在于人類線粒體內(nèi)膜，是一種含鐵的黃素依賴酶，在嘧啶從頭合成途徑中起著關鍵的作用。DHODH抑制劑影響嘧啶合成，早在1959年就被證明可以抑制腫瘤。來氟米特(Leflunomide)是

2、一種5~甲基異惡唑~4~甲酰胺衍生物，是第一個被批準用于臨床治療的 DHODH抑制劑。近年來，不論是在體外細胞培養(yǎng)還是動物模型研究中，DHODH的失活或者下調可以明顯抑制腫瘤的增殖，尤其是在黑色素瘤。因此DHODH可能成為新的腫瘤治療靶點， leflunomide有望成為新型腫瘤靶向治療藥物。但來氟米特在黑色素瘤中的作用尚無報道，因此本研究通過觀察 leflunomide抑制 DHODH及干涉DHODH兩種方法對惡性黑色素瘤細胞A375

3、和MV3增殖、周期、死亡的影響，探索抑制 DHODH對軟瓊脂克隆形成和荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況，進一步探究抑制 DHODH引起腫瘤細胞增殖抑制、死亡的機制。
　　方法：
　　1.采用臺盼藍染色計數(shù)法、MTT（四甲基偶氮唑藍）比色法分析不同濃度的leflunomide（0μM、50μM、100μM、200μM）分別在24h、48h、72h、96h四個時間點對人黑色素瘤細胞增殖抑制作用，同時應用BrdU免疫熒光對leflu

4、nomide及干涉DHODH抑制A375和MV3細胞增殖情況進行分析；
　　2.應用PI單染流式細胞技術、Western Blot分析檢測leflunomide及干涉DHODH對細胞周期的影響；
　　3.通過AnnexinV~FITC/PI雙染流式細胞分析和Hoechst33342染色驗證leflunomide是否能誘導黑色素瘤細胞凋亡；
　　4.采用Western Blot、免疫熒光和GFP~Lc3B瞬轉實驗驗證le

5、flunomide是否誘導A375和MV3細胞發(fā)生自噬；
　　5.通過細胞周期分析及Western Blot分析補充外源性尿嘧啶或者過表達DHODH后是否可以挽救細胞周期阻滯及自噬；
　　6.軟瓊脂克隆形成分析和小鼠體內(nèi)成瘤實驗驗證leflunomide是否能抑制黑色素瘤細胞A375和MV3的成瘤能力。
　　結果：
　　1.細胞計數(shù)和MTT結果顯示leflunomide能抑制A375細胞增殖，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴

6、關系；BrdU免疫熒光染色進一步證實，與DMSO對照組相比，leflunomide處理組BrdU陽性細胞百分比顯著降低；
　　2.PI單染流式細胞分析顯示：與DMSO對照組相比，leflunomide處理組細胞周期S期比例顯著增加，而G0/G1期比例相應減少，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)處理組周期蛋白CDK2，cyclinA2表達水平相應降低,外源性尿嘧啶可以挽救這種周期阻滯；
　　3.通過顯微鏡下形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)lefl

7、unomide處理組中A375細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)改變， AnnexinV~FITC/PI雙染染流式細胞分析顯示在A375細胞中l(wèi)eflunomide處理組出現(xiàn)明顯的凋亡；而在MV3細胞中DMSO對照組及l(fā)eflunomide處理組中都沒有明顯凋亡；
　　4.Western Blot結果顯示與DMSO對照組相比leflunomide可誘導A375和MV3細胞中LC3B~Ⅰ降解成LC3B~Ⅱ，使細胞發(fā)生自噬。免疫熒光及GFP~Lc

8、3B結果顯示與DMSO對照組相比，leflunomide處理組可見明顯點狀LC3B聚集；實驗組與對照組LC3B陽性細胞百分比有顯著性差異，
　　5.臺盼藍染色計數(shù)和MTT結果均顯示通過shRNA技術干涉DHODH可以抑制A375和MV3細胞增殖；BrdU免疫熒光染色進一步證實，與scramble對照組相比，干涉DHODH后BrdU陽性細胞百分比顯著降低；
　　6.PI單染流式細胞技術分析顯示：與scramble對照組相比，干

9、涉DHODH后細胞周期S期比例顯著增加，而G0/G1期細胞所占比例顯著降低，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)處理組周期蛋白CDK2，cyclinA2表達水平相應降低。外源性尿嘧啶或者過表達DHODH可以挽救這種周期阻滯；
　　7.通過顯微鏡下形態(tài)學觀察、Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)，PI單染流式細胞分析顯示在scramble對照組或干涉DHODH組的A375和MV3細胞中均沒有明顯凋亡；
　　8.Western~Blot

10、結果顯示與scramble對照組相比干涉DHODH組可誘導A375和MV3細胞中LC3B~Ⅰ降解成LC3B~Ⅱ，使細胞發(fā)生自噬。免疫熒光及GFP~Lc3B結果顯示實驗組與對照組之間有顯著性差異，與scramble對照組相比，干涉DHODH組可見明顯點狀LC3B聚集；；
　　9.軟瓊脂克隆形成實驗顯示與DMSO對照組相比，leflunomide處理組克隆形成數(shù)顯著降低；與scramble對照組相比，干涉DHODH后細胞克隆形成數(shù)顯著

11、降低。黑色素瘤細胞體內(nèi)異種移植NOD/SCID小鼠模型的研究結果顯示leflunomide治療組的腫瘤體積和平均瘤重，顯著低于對照組腫瘤體積和平均瘤重。
　　結論：
　　1.本研究表明兩種方法leflunomide抑制DHODH，干涉DHODH能夠抑制黑色素瘤細胞增殖及克隆形成，體內(nèi)實驗證明DHODH抑制劑leflunomide或者干涉DHODH可以抑制細胞體外及小鼠體內(nèi)成瘤能力。由此，DHODH可能是黑色素瘤細胞增殖及生存