沉默miR-769表達對抑制黑色素瘤細胞增殖的實驗研究.pdf

1、目的:
　　確定黑色素瘤中miR-769表達是否異常并篩選其靶基因，研究其具體發(fā)病機制及驗證沉默miR-769能否抑制黑色素瘤細胞增殖。
　　方法:
　　1、實驗對象與分組
　?、俸谏亓龌颊叩牟±順吮荆床±矸制诿麨樵唤M（10例）和轉移組（14例）;24例正常色素痣病理標本命名為色素痣組。7種黑色素瘤細胞株命名為MM組，人表皮黑色素細胞系命名為PEM組。
　?、诤谏亓鯝375細胞株命名為A375組;

2、黑色素瘤細胞株A375分三組分別轉染miR-769 mimics、miR-769-inhibitor和隨機RNA序列，命名為mimics組，inhibitor組和NC組。
　　③GSK3β野生型質粒和突變型質粒分別轉染A375細胞株，命名為WT組和MUT組。
　　④inhibitor組分別再轉染干擾RNA GSK3β-siRNA＃1和GSK3β-siRNA＃2，命名為RNA干擾組。
　　2、病理標本和黑色素瘤細胞中mi

3、R-769表達
　　黑色素瘤（原位組、轉移組）與色素痣組的病理標本; PEM組與MM組細胞株分別進行QRT-PCR試驗，測定miR-769表達量并對比。
　　3.miR-769作用機制研究
　　Western Blot檢測MM組、inhibitor組和PEM組細胞中GSK3β的表達量;雙熒光素酶試驗測定mimics組、inhibitor組、MUT組熒光素酶的活性;Western Blot檢測inhibitor組和NC組

4、的cyclin D1和c-myc的表達量。
　　4、沉默miR-769研究
　　mimics組，inhibitor組和 NC組分別進行QRT-PCR實驗、MTT試驗、平板細胞克隆實驗和BrdU細胞增殖實驗。
　　RNA干擾組分別進行Western Blot實驗、平板細胞克隆形成實驗、錨定非依賴生長分析實驗、BrdU細胞增殖實驗。
　　5.統(tǒng)計分析
　　采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，對數據進行方差分析、t檢驗

5、、卡方檢驗。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.QRT-PCR檢測miR-769表達
　　黑色素瘤病理標本轉移組中miR-769的平均表達水平最高，其次是原位組，色素痣組最低;MM組中miR-769的平均表達水平較PEM組高。
　　2.miR-769作用機制
　　Western Blot: inhibitor組GSK3β的表達量最高，其次是NC組，A375組幾乎沒有。雙熒光素酶報告:m

6、imics組的細胞熒光素酶活性降低，inhibitor組升高，MUT組的不變。Western Blot: A375組中cyclin D1和c-myc表達明顯提高;inhibitor組表達下降。
　　3.沉默miR-769
　　QRT-PCR: mimics組miR-769表達最高，其次是NC組，inhibitor組最低;MTT試驗:mimics組OD值最高，NC組其次，inhibitor組最低;平板細胞克隆實驗中mimics

7、組細胞克隆形成率最高，NC組其次，inhibitor組最低;BrdU細胞增殖實驗中mimics組S期細胞比例最高，NC組其次，inhibitor組最低。
　　Western Blot:RNA干擾組GSK3β的蛋白條帶幾乎沒有;平板細胞克隆結果:RNA干擾組中細胞克隆形成率顯著升高;錨定非依賴生長分析實驗:RNA干擾組中直徑大于0.1mm集落數目顯著高于NC組;BrdU細胞增殖實驗:RNA干擾組中S期細胞比例明顯高于NC組。