沉默miR-769表達(dá)對(duì)抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　確定黑色素瘤中miR-769表達(dá)是否異常并篩選其靶基因，研究其具體發(fā)病機(jī)制及驗(yàn)證沉默miR-769能否抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組
　?、俸谏亓龌颊叩牟±順?biāo)本，按病理分期命名為原位組（10例）和轉(zhuǎn)移組（14例）;24例正常色素痣病理標(biāo)本命名為色素痣組。7種黑色素瘤細(xì)胞株命名為MM組，人表皮黑色素細(xì)胞系命名為PEM組。
　?、诤谏亓鯝375細(xì)胞株命名為A375組;

2、黑色素瘤細(xì)胞株A375分三組分別轉(zhuǎn)染miR-769 mimics、miR-769-inhibitor和隨機(jī)RNA序列，命名為mimics組，inhibitor組和NC組。
　?、跥SK3β野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株，命名為WT組和MUT組。
　?、躨nhibitor組分別再轉(zhuǎn)染干擾RNA GSK3β-siRNA＃1和GSK3β-siRNA＃2，命名為RNA干擾組。
　　2、病理標(biāo)本和黑色素瘤細(xì)胞中mi

3、R-769表達(dá)
　　黑色素瘤（原位組、轉(zhuǎn)移組）與色素痣組的病理標(biāo)本; PEM組與MM組細(xì)胞株分別進(jìn)行QRT-PCR試驗(yàn)，測定miR-769表達(dá)量并對(duì)比。
　　3.miR-769作用機(jī)制研究
　　Western Blot檢測MM組、inhibitor組和PEM組細(xì)胞中GSK3β的表達(dá)量;雙熒光素酶試驗(yàn)測定mimics組、inhibitor組、MUT組熒光素酶的活性;Western Blot檢測inhibitor組和NC組

4、的cyclin D1和c-myc的表達(dá)量。
　　4、沉默miR-769研究
　　mimics組，inhibitor組和 NC組分別進(jìn)行QRT-PCR實(shí)驗(yàn)、MTT試驗(yàn)、平板細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)和BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
　　RNA干擾組分別進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)、平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、錨定非依賴生長分析實(shí)驗(yàn)、BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)

5、、卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.QRT-PCR檢測miR-769表達(dá)
　　黑色素瘤病理標(biāo)本轉(zhuǎn)移組中miR-769的平均表達(dá)水平最高，其次是原位組，色素痣組最低;MM組中miR-769的平均表達(dá)水平較PEM組高。
　　2.miR-769作用機(jī)制
　　Western Blot: inhibitor組GSK3β的表達(dá)量最高，其次是NC組，A375組幾乎沒有。雙熒光素酶報(bào)告:m

6、imics組的細(xì)胞熒光素酶活性降低，inhibitor組升高，MUT組的不變。Western Blot: A375組中cyclin D1和c-myc表達(dá)明顯提高;inhibitor組表達(dá)下降。
　　3.沉默miR-769
　　QRT-PCR: mimics組miR-769表達(dá)最高，其次是NC組，inhibitor組最低;MTT試驗(yàn):mimics組OD值最高，NC組其次，inhibitor組最低;平板細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)中mimics

7、組細(xì)胞克隆形成率最高，NC組其次，inhibitor組最低;BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中mimics組S期細(xì)胞比例最高，NC組其次，inhibitor組最低。
　　Western Blot:RNA干擾組GSK3β的蛋白條帶幾乎沒有;平板細(xì)胞克隆結(jié)果:RNA干擾組中細(xì)胞克隆形成率顯著升高;錨定非依賴生長分析實(shí)驗(yàn):RNA干擾組中直徑大于0.1mm集落數(shù)目顯著高于NC組;BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):RNA干擾組中S期細(xì)胞比例明顯高于NC組。