脊髓反應性星形膠質(zhì)細胞模型的建立和轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、目的：在脊髓星形膠質(zhì)細胞受到損傷活化為反應性星形膠質(zhì)細胞后，探討亞低溫和過表達NeuroD1對脊髓反應性星形膠質(zhì)細胞的影響。
　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)原代新生SD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞：從新生1~3dSD大鼠脊髓組織中提取并純化星形膠質(zhì)細胞，通過免疫熒光及流式細胞儀檢測星形膠質(zhì)細胞純度，用于制備反應性星形膠質(zhì)細胞（ReactiveAstrocytes，RAS）。
　　2、劃痕實驗制備RAS：利用10μl無菌加樣槍頭在

2、培養(yǎng)板中沿“井”字樣劃痕，控制統(tǒng)一的力度和速度。劃痕損傷后，更換培養(yǎng)基，并利用免疫熒光檢測RAS純度。
　　3、亞低溫對劃痕損傷后RAS的影響：試驗細胞分為4組：對照組、劃痕組、亞低溫組和劃痕+亞低溫組。其中對照組細胞為未經(jīng)劃痕損傷并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，劃痕組細胞行劃痕實驗并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，亞低溫組細胞未經(jīng)劃痕損傷并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，劃痕+亞低溫組細胞行劃痕實驗并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細胞在相應的時間點觀察

3、細胞形態(tài)，利用免疫熒光染色方法檢測Nestin陽性率，MTT比色法檢測細胞活性，PI染色方法檢測細胞凋亡程度。
　　4、牽張實驗制備RAS：牽張損傷實驗裝置由Bioflex細胞培養(yǎng)板、CICⅡ型細胞損傷儀、高純氮氣組成。調(diào)整計量閥門壓力為12PSI（Poundspersquareinch），打擊后峰值為3PSI。牽張損傷后，更換培養(yǎng)基，并利用免疫熒光檢測RAS純度。
　　5、亞低溫對牽張損傷后RAS的影響：試驗細胞分為4組：

4、對照組、牽張組、亞低溫組和牽張+亞低溫組。其中對照組細胞為未經(jīng)牽張損傷并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，牽張組細胞行牽張實驗并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，亞低溫組細胞未經(jīng)牽張損傷并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，牽張+亞低溫組細胞行牽張實驗并置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細胞在相應的時間點觀察細胞形態(tài)，利用MTT比色法檢測細胞活性，乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）釋放量檢測細胞損傷程度。
　　6、過表達NeuroD1對劃痕

5、后RAS的影響：試驗分為3組：空白組（NV組）、對照病毒組（GFP組）和NeuroD1病毒組（NeuroD1組）。各組細胞行劃痕實驗后，NV組細胞不接受病毒感染，攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染GFP組細胞，同時攜帶GFP和NeuroD1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NeuroD1組細胞，24h后同時更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基。各組細胞在相應時間點觀察細胞形態(tài)變化，并在感染病毒后7d和14d分別利用免疫熒光染色方法檢測細胞DCX陽性率和檢測細胞NeuN陽

6、性率。
　　結(jié)果：
　　1、原代脊髓星形膠質(zhì)細胞的純度檢測：利用GFAP免疫熒光檢測第3次傳代后，星形膠質(zhì)細胞的GFAP陽性率達到95％以上。利用流式細胞儀檢測純度可達到93.94%。
　　2、劃痕損傷和牽張損傷后RAS純度檢測：利用Nestin/GFAP免疫熒光雙染檢測劃痕損傷和牽張損傷后RAS純度，RAS純度可以用Nestin陽性率表示，劃痕損傷和牽張損傷后RAS的Nestin陽性率都在80%以上。
　　3、

7、光學顯微鏡觀察劃痕損傷后細胞形態(tài)改變：細胞受到劃痕損傷后，細胞胞體變得肥大，周圍的突起開始增多并逐漸延展，細胞的胞漿變得豐富。處于亞低溫環(huán)境的細胞，變化相比減慢，周圍突起增多不明顯，并且細胞逐漸深入劃痕處所需要的時間增加。
　　4、光學顯微鏡觀察牽張損傷后細胞形態(tài)改變：細胞受到牽張損傷后，星形膠質(zhì)細胞活化為反應性星形膠質(zhì)細胞，細胞胞體腫大，細胞周圍突起及連接多處斷裂，并且細胞開始活化增生。處于亞低溫環(huán)境的細胞，細胞變化不明顯，斷裂

8、處恢復所需時間減少。
　　5、劃痕損傷后檢測各組細胞Nestin陽性率來反應損傷后的活化程度：與對照組和亞低溫組相比，劃痕組和劃痕+亞低溫組明顯升高，說明劃痕損傷引起星形膠質(zhì)細胞活化，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與劃痕組相比，劃痕+亞低溫組又較低，說明亞低溫可以抑制星形膠質(zhì)細胞活化，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　6、劃痕損傷后檢測各組細胞PI陽性率來反應損傷后的凋亡程度：與劃痕組和劃痕+亞低溫組相比，對照組和

9、亞低溫組PI陽性率降低，說明劃痕造成細胞凋亡，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與劃痕組相比，劃痕+亞低溫組PI陽性率降低，表明亞低溫可以抑制星形膠質(zhì)細胞凋亡，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　7、劃痕損傷后檢測各組細胞MTT值來反應損傷后的生長率：與劃痕組和劃痕+亞低溫組相比，對照組和亞低溫組生長率在第3d后明顯下降，說明劃痕引起細胞增生。與劃痕組相比，劃痕+亞低溫組各時間點生長率明顯降低，表明亞低溫可以抑制細胞活化增生。且具

10、有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　8、牽張損傷后檢測各組細胞MTT值來反應損傷后的生長率：在損傷后的3d或5d，損傷組與對照組相比、損傷+亞低溫組與亞低溫組相比較，都是前者大于后者，表明牽張損傷后會導致RAS的增生。損傷組與損傷+亞低溫組相比較，在損傷后3d，前者增長速率大于后者，表明亞低溫可以抑制RAS的增生。且都具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　9、牽張損傷后檢測各組細胞LDH值來反應細胞的損傷程度：在損傷后1d，

11、損傷組與對照組相比、損傷+亞低溫組與亞低溫組相比較，表明牽張損傷后會RAS受到損傷，并且在損傷后的2d，損傷組的LDH釋放率大于1d時的值，表明損傷組RAS進一步損傷。損傷組與損傷+亞低溫組相比較，在損傷后2d，前者LDH釋放率大于后者，表明亞低溫可以抑制RAS的損傷程度。且都具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　10、光學顯微鏡觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞后形態(tài)改變：在病毒感染后的7d內(nèi)，各組細胞發(fā)生形態(tài)改變，胞核飽滿明顯，胞漿變得減

12、少，周圍突起逐漸減少并延長。與NeuroD1組細胞相比，NV組和GFP組周圍突起短而分枝多，胞核變化不明顯。感染7d后，NV組和GFP組細胞形態(tài)逐漸恢復到以前形態(tài)，而NeuroD1組細胞維持當前形態(tài)。
　　11、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞7d后DCX陽性率：與NV組和GFP組的陽性率相比，NeuroD1組細胞的DCX陽性率增加明顯，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　12、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞14d后NeuN陽性率：與NV組和GF

13、P組的陽性率相比，NeuroD1組細胞的NeuN陽性率增加明顯，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、劃痕損傷后星形膠質(zhì)細胞活化為RAS并會增生，亞低溫明顯抑制脊髓RAS的活化增生，并可以抑制RAS的凋亡。
　　2、牽張損傷后RAS突起及細胞連接處會發(fā)生斷裂，損傷后細胞增生明顯。亞低溫可明顯抑制RAS的活化增生，同時可以抑制細胞的進一步損傷。
　　3、細胞在體外培養(yǎng)中，NeuroD1的過表達可以