尿液中鄰苯二甲酸酯類代謝物的檢測方法的建立與應用.pdf

1、為了檢測尿液中鄰苯二甲酸酯類(Phthalate ester，PAE)代謝物的含量，了解在人群中PAE暴露的水平，我們首先建立了固相萃取(solid-phase extraction，SPE)/氣相色譜質譜(gaschromatographic mass spectrometry, GC-MS)聯(lián)用和“NH4PF6增強的，無有機溶劑二次微萃取”(“NH4PF6-enhanced，non-organic solvent，dual micr

2、oextraction，ANSDM”)腐效液柑色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)聯(lián)用的兩種檢測人尿液中PAE代謝物的方法(即SPE/GC-MS和ANSDM/HPLC)。然后選擇最優(yōu)方法，進行實際尿液樣品檢測，具體考察了2型糖尿病患者和六種疾病對照以及健康體檢人群的尿液樣本。最后獲得了各組人群PAE代謝物暴露的水平和特點。
　　主要內容共分為三部分進行闡述:
　　第一

3、部分:我們構建了SPE/GC-MS方法用于檢測尿液中PAE代謝物。應用傳統(tǒng)的富集和提取樣本中痕量物質的方法，結合氣相色譜質譜平臺檢測待檢物是本章的最終目的。我們對SPE和GC-MS的結合進行一系列條件的優(yōu)化。由于SPE在富集與提取PAE代謝物方面前人已有很多研究，已具備成熟的技術與條件，故此本章將重點將放在GC-MS條件的優(yōu)化上。GC-MS條件優(yōu)化最重要和最必要的是衍生化條件的優(yōu)化。PAE代謝物衍生化最佳條件為:加入30μL雙（三甲基硅

4、烷基）三氟乙酰胺(N，O-bis(trimethylsilyl) trifluoroaceta-mide，BSTFA)，1μL三甲基氯硅烷(trimethyl chlorosilane，TMCS)和70μL吡啶于30℃下衍生化30 min?；谶@個衍生化條件，方法的線性范圍是2～800 ng/mL，線性系數范圍是0.9900～0.9982，有較好的線性關系。最低檢測限在0.1～0.33ng/mL之間。日內和日間相對標準偏差(relati

5、ve standard deviation，RSDs)在0.53％～6.95％之間，具有良好的精密度。方法的回收率為73.1％～116.8％?？傊摲椒ㄊ且粋€常規(guī)的較為準確的測定尿液中PAE代謝物的方法。
　　第二部分:在這部分，我們開發(fā)了一種新型的“NH4PF6增強的，無有機溶劑二次微萃取”方法，即ANSDM方法。在常規(guī)的離子液體分散劑液液微萃取(ionic liquid-based dispersive liquid-liqu

6、id microextraction，IL-DLLME)的程序中，IL分散劑由于“延遲效應”(carry-over effect)大部分保留在了水相中，導致弱極性和中等極性化合物的低回收率。在此，我們成功地開發(fā)了ANSDM方法來萃取同時具有弱極性和中等極性的PAE代謝物。在這個方法中，NH4PF6作為離子交換劑參與原位反應，使用[C8MIM]PF6作為提取溶劑，[C4MIM]BF4作為分散劑，從而實現(xiàn)二次微萃取。利用單因素實驗(Sing

7、le-factor experiments)，兩水平全因子實驗設計(a two-level full factorial experimental design)和3D響應面曲線法之中心組成設計(central composite design)來進行方法的優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，測到尿液PAE代謝物較高的回收率(93.8～99.1％)和較低的檢測限（約0.3μg/mL）。ANSDM方法的主要優(yōu)點包括:(1)對弱極性和中等極性的分析物具有較

8、高的提取效率;(2)使用環(huán)境友好的試劑;(3)節(jié)省時間的前處理工序;(4)簡單的操作和用HPLC分析完全兼容?？偠灾珹NSDM方法不但可用于尿液基質的預處理，在人尿PAE代謝物的痕量水平的定量方面具有良好的前景，同時該方法也顯示出對其他可能潛在的生物樣品或環(huán)境樣品的良好的預處理能力的前景。
　　第三部分，我們利用ANSDM/HPLC方法檢測了T2DM和6種疾病人群及健康體檢人群尿液中PAE代謝物含量。PAE代謝物與T2DM的相

9、關性已被很多研究證實，且這種相關性具有人種和性別以及地域的差異性，在中國目前還未有同時重點考察多種疾病人群PAE代謝物的檢測的研究。除了T2DM共50例尿液樣本以外，我們選取了六種對照疾病組，它們分別是結直腸癌(Colorectalcancer)共32例，胃癌(Gastric cancer)共30例，高血壓病(Hypertensive disease)共31例，肺癌(Lung cancer)共39例，前列腺癌(Prostatic can

10、cer)共30例以及乳腺癌(Breast cancer)共30例等。我們選取了兩種消化道腫瘤疾病，一種心血管疾病，一種呼吸道疾病，兩種生殖系統(tǒng)腫瘤疾病，另外作為空白對照，我們也選取了65例健康體檢(Healthy physical examination)人群的尿液參與研究，所有樣本量大約300例。利用ANSDM/HPLC方法，本次檢測結果如下:(1)在七種疾病組和健康體檢組的尿液中均完全檢測到PAE代謝物，檢出率100％;(2)在T2

11、DM組中，MBzP的平均濃度最大為43.90 ng/mL，其余兩者分別是MiBP的42.32 ng/mL和MBzP的43.90 ng/mL，而MiBP檢測到最大值比其余兩者的更大為113.80 ng/mL，MBzP最大值為98.10 ng/mL，MEHP的最大值為78.10ng/mL;(3)與其余疾病組和健康對照組相比，T2DM組的PAE代謝物含量明顯較高，具有統(tǒng)計學顯著性;(4)高血壓病組的MEHP含量相比健康對照組具有統(tǒng)計學顯著性。

12、從ANSDM/HPLC方法的實際檢測效果來看，該方法簡單、省時省力、不使用有機溶劑、環(huán)境友好，同時對尿液中PAE代謝物具有高回收率。ANSDM/HPLC法檢測人尿液中PAE代謝物的方法是一個深具前景的方法，PAE代謝物在T2DM患者尿液中的含量與健康體檢者和其他疾病相比具有顯著的統(tǒng)計學意義，PAE代謝物也可以作為T2DM的風險因子指導臨床的預防與診斷。
　　總之，通過兩種檢測尿液中PAE代謝物方法的建立和比較，我們確定了一個高效、