20(S)-人參皂苷Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的索拉非尼敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索20(S)-人參皂苷Rg3(Rg3)對(duì)肝癌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的索拉非尼藥物敏感性的影響，并研究其機(jī)制，為臨床聯(lián)合藥物治療肝癌提供理論參考。
　　方法:以人肝癌細(xì)胞株Hep3B為觀察對(duì)象，分別接受Rg3、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)索拉非尼、Rg3+索拉非尼和3-MA+索拉非尼處理，采用MTT法檢測(cè)Hep3B細(xì)胞對(duì)Rg3、索拉非尼及3-MA的敏感性;CCK-8法檢測(cè)Rg3、3-MA分別聯(lián)合不同濃度索拉非尼后對(duì)

2、Hep3B細(xì)胞的增殖抑制作用，q值判斷聯(lián)合用藥效果;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組藥物對(duì)Hep3B細(xì)胞的增殖抑制率;利用倒置熒光顯微鏡（丫啶橙染色）及透射電鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量;LC3 Conversion實(shí)驗(yàn)及LC3 Turnover實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rg3和索拉非尼對(duì)Hep3B細(xì)胞自噬的影響;Western blotting檢測(cè)Rg3和索拉非尼對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、p62水平的影響。
　　結(jié)果:1.MT

3、T結(jié)果顯示，Rg3、索拉非尼及3-MA對(duì)肝癌細(xì)胞株Hep3B的增殖抑制呈明顯的“量效關(guān)系”和“時(shí)效關(guān)系”。2.CCK-8結(jié)果顯示:低、中、高濃度索拉非尼聯(lián)合Rg3前后的抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。低、中濃度索拉非尼聯(lián)合3-MA前后亦有顯著差異(P＜0.01)，但高濃度與之聯(lián)合前后差異不明顯(P＞0.05)。q值計(jì)算結(jié)果顯示:低、中濃度索拉非尼聯(lián)合Rg3及3-MA后表現(xiàn)為協(xié)同作用;高濃度與其聯(lián)合后表現(xiàn)

4、均為相加作用。3.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，索拉非尼單藥增殖抑制率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，Rg3和3-MA抑制不明顯(P＞0.05)，索拉非尼聯(lián)合Rg3或3-MA增殖抑制率均高于索拉非尼單藥(P＜0.05)。4.倒置熒光顯微鏡和透射電鏡顯示，與對(duì)照組相比，Rg3組、素拉非尼組細(xì)胞自噬體數(shù)量明顯增加，但3-MA組增加不明顯，索拉非尼聯(lián)合3-MA后自噬體數(shù)量明顯減少，但聯(lián)合Rg3后減少不顯著。5.LC3 Convers

5、ion實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著藥物作用時(shí)間(0h、8h、16h、24h)的延長(zhǎng)，Rg3及索拉非尼均使Hep3B細(xì)胞株LC3-Ⅱ蛋白水平不斷升高;LC3 Turnover實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:索拉非尼聯(lián)合氯喹(CQ)作用24h后，LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高(P＜0.01)，而Rg3聯(lián)合CQ前后LC3-Ⅱ水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。6.Western-blotting結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，Rg3、索拉非尼均可使Beclin1蛋白表達(dá)升高(P＜0.0

6、1)，而3-MA對(duì)Beclin1表達(dá)無(wú)影響(P＞0.05)，索拉非尼聯(lián)合3-MA后Beclin1水平明顯降低（P＜0.01），而聯(lián)合Rg3后下降不明顯(P＞0.5)。Rg3、3-MA及索拉非尼均可使LC3-Ⅱ水平升高(P＜0.01; P＜0.05; P＜0.01)，索拉非尼聯(lián)合Rg3后LC3-Ⅱ水平高于索拉非尼單藥(P＜0.01)，而索拉非尼聯(lián)合3-MA前后LC3-Ⅱ水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)。3-MA、索拉非尼組p62蛋白水平明顯

7、低于對(duì)照組(P＜0.01;P＜0.05)，而Rg3對(duì)其水平無(wú)明顯影響(P＞0.05)，索拉非尼聯(lián)合Rg3后p62水平明顯升高(P＜0.01)，聯(lián)合3-MA后水平明顯降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1.索拉非尼可通過(guò)增加Beclin1的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，從而導(dǎo)致其藥物敏感性下降。2.低濃度的Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制不明顯，但可增加索拉非尼的敏感性，其機(jī)制是通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞自噬降解活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，值得進(jìn)一步研究。3.本研究為索拉