基于ARHGAP9基因的人參皂苷Rg3抗肝癌作用機(jī)制研究.pdf

1、高侵襲轉(zhuǎn)移是原發(fā)性肝癌（簡(jiǎn)稱“肝癌”）重要的生物學(xué)特性，也是導(dǎo)致肝癌高死亡率的重要原因。然而，其發(fā)病機(jī)制并不明確，阻礙了肝癌的有效診治。近幾年研究表明，RhoGAP蛋白家族的許多成員，如p190RhoGAP、DLC1和ARHGAP在人肝癌組織中明顯上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，ARHGAP9基因在肝癌組織中明顯低表達(dá)，且低表達(dá)患者相對(duì)于高表達(dá)患者預(yù)后差。ARHGAP9的高表達(dá)還抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路的激活。由此我們推測(cè)，ARHGAP

2、9基因與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　人參皂苷Rg3是人參的重要組成部分，對(duì)多種惡性腫瘤均具有抑制作用。由于其顯著的抗癌療效，人參皂苷Rg3的單體已被開發(fā)成我國(guó)一類抗癌新藥—參一膠囊。實(shí)驗(yàn)和臨床研究均已證實(shí)，人參皂苷Rg3在治療肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而，人參皂苷Rg3抗肝癌的作用機(jī)制研究并不深入，缺乏臨床治療依據(jù)，限制了人參皂苷Rg3在臨床上的廣泛應(yīng)用。鑒于我們前期發(fā)現(xiàn)，ARHGAP9與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，人參皂苷Rg3

3、抗肝癌是否與ARHGAP9基因相關(guān)值得深入探討。
　　因此本課題的研究主要分為兩個(gè)部分:(1)分析ARHGAP9基因在肝癌生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用;(2)確定人參皂苷Rg3是否通過(guò)ARHGAP9基因抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移。
　?。ㄒ唬〢RHGAP9在肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　我們首先通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和慢病毒感染構(gòu)建了ARHGAP9基因干擾的肝癌細(xì)胞株和過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞株。然后采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell

4、等一系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析ARHGAP9基因干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)腋下注射ARHGAP9過(guò)表達(dá)的HepG2肝癌細(xì)胞株建立裸鼠皮下成瘤模型，分析ARHGAP9對(duì)裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)情況的影響。取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、ARHGAP9在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　6種肝癌細(xì)胞株中，ARHGAP9基因表達(dá)最高的是MHCC-97L細(xì)胞，其余5種細(xì)胞株中ARHGAP9基因的表達(dá)相對(duì)較低且相互之

5、間無(wú)顯著性差異。因此選擇MHCC-97L細(xì)胞進(jìn)行基因干擾研究，選擇HepG2和MHCC-97H細(xì)胞進(jìn)行基因過(guò)表達(dá)研究。
　　2、干擾ARHGAP9基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、周期和凋亡的影響
　　干擾ARHGAP9基因顯著促進(jìn)了MHCC-97L細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，且S期細(xì)胞比率增加。
　　3、過(guò)表達(dá)ARHGAP9基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、周期和凋亡的影響
　　過(guò)表達(dá)ARHGAP9基因顯著抑制了HepG2和MHCC-97H細(xì)

6、胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
　　4、ARHGAP9對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響
　　干擾ARHGAP9基因顯著促進(jìn)了MHCC-97L細(xì)胞的遷移和侵襲，過(guò)表達(dá)ARHGAP9基因顯著抑制了HepG2和MHCC-97H細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　5、ARHGAP9對(duì)裸鼠肝癌生長(zhǎng)的影響
　　ARHGAP9過(guò)表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組。從第24天開始，ARHGAP9過(guò)表達(dá)組腫瘤體積較對(duì)照組明顯

7、降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果顯示，ARHGAP9基因高表達(dá)顯著抑制肝癌發(fā)展過(guò)程。
　?。ǘ┗贏RHGAP9的人參皂苷Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響
　　我們采用CCK-8、Transwell、PCR、Western blot以及基因干擾等實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度20(R)-Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)ARHGAP9表達(dá)的影響。取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、人參皂苷Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞活力的

8、影響
　　采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度人參皂苷Rg3對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響。當(dāng)Rg3處理HepG2和MHCC-97L細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組（1.25、2.5和5μg/mL）的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、人參皂苷Rg3抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移
　　人參皂苷Rg3在濃度為1.25、2.5和5μg/mL時(shí)均顯著抑制了HepG2和MHCC-97L細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　3、人參皂苷Rg3提高肝癌細(xì)胞中ARH

9、GAP9的表達(dá)
　　與對(duì)照組相比，人參皂苷Rg3（2.5和5μg/mL）顯著提高了HepG2和MHCC-97L細(xì)胞中ARHGAP9蛋白的表達(dá)。
　　4、人參皂苷Rg3通過(guò)ARHGAP9抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移
　　沉默ARHGAP9基因后顯著緩解了人參皂苷Rg3（2.5和5μg/mL）對(duì)HepG2和MHCC-97L細(xì)胞的抗侵襲遷移作用。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移，且此過(guò)程與