人參皂苷Rg3抗肺癌機制及增加吉非替尼藥物敏感性的研究.pdf

1、一、目的與意義：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡率中居第一位。主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩大類型，其中非小細胞肺癌是最常見的類型，約占85％。雖然在過去的幾十年放化療取得巨大的進步，由于毒副作用的產(chǎn)生限制了它們的應用。近幾年，靶向藥物如吉非替尼不斷問世，肺癌的治療取得一定的成績，然而，多數(shù)患者在治療一年內(nèi)產(chǎn)生耐藥，使得肺癌患者的前景依然暗淡。對于肺癌的治療依然需要尋求機制明確的新靶點、新藥物及新的治療策

2、略。
　　腫瘤糖生物學研究表明特定的糖基合成與腫瘤轉移密切相關，研究證實巖藻糖基化在腫瘤增殖與轉移中起著關鍵作用。在胰腺癌中，降低巖藻糖sLe a和sLe x的表達抑制了E-selectin介導的腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞的粘附以及細胞在裸鼠體內(nèi)的轉移能力。異常的巖藻糖基化是由特定的巖藻糖基轉移酶（fucosyltransferases，F(xiàn)UTs）催化合成。FUT4是巖藻糖基轉移酶其中之一，定位于高爾基體上，能夠催化GDP-Fuc的Fuc

3、轉移至糖鏈中N-乙酰氨基葡萄糖上，是合成糖抗原LeY的關鍵酶。FUT4在多種腫瘤中高表達，如胃癌、胰腺癌、結腸癌和卵巢癌等。FUT4的表達水平與腫瘤的增殖、凋亡、轉移及EMT密切相關。下調(diào)FUT4能夠抑制乳腺癌的增殖，促進惡性黑色素瘤A431細胞凋亡，抑制乳腺癌EMT。但FUT4是否與肺癌的EMT有關還不清楚。
　　吉非替尼是EGFR-TKIs藥物其中之一，已經(jīng)被很好的確立為肺癌患者的治療選擇。吉非替尼連接在 EGFR上抑制它的下

4、游通路，這些通路涉及腫瘤增殖、遷移、侵襲以及血管生成的激活。雖然NSCLC患者在剛開始對吉非替尼敏感，但是大多數(shù)在一年內(nèi)發(fā)生了耐藥，形成了這些有效治療途徑的最大限制。目前，接受吉非替尼治療的肺癌患者病情發(fā)生進展，還沒有更好的治療選擇。引起肺癌患者對吉非替尼發(fā)生耐藥的機制有EGFR的二次突變（19號外顯子上的D761Y，20號外顯子上的T790），MET的擴增，持續(xù)性survivin過表達，JAK2/STAT3的組成性激活和PI3K/Ak

5、t通路的激活。據(jù)顯示STAT3在很多腫瘤治療中，已經(jīng)被證實是一個比較有吸引力的治療靶點，它的持續(xù)性激活可以被JAK家族、EGFR和SRC誘導。STAT3的激活在腫瘤進展中通過促進細胞增殖、細胞生存、血管生成和腫瘤免疫逃避發(fā)揮重要作用，同時它與腫瘤患者預后差相關。因此，有效抑制STAT3的激活是提高吉非替尼藥物敏感性的一個關鍵性需要。
　　人參皂苷是從傳統(tǒng)中藥人參中提取的活性單體藥物成分，具有廣泛的藥理學活性和治療作用。目前，有40

6、多種人參皂苷化合物被認定，其中，Rg3受到越來越多的關注。Rg3應用于多種腫瘤的抗腫瘤治療，包括乳腺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、卵巢癌等。報道顯示 Rg3在肺癌治療中也取得了令人矚目的效果。目前，臨床上常用的藥物參一膠囊，其主要成分為 Rg3，已經(jīng)在中國被批準為治療晚期非小細胞肺癌的輔助藥物。Rg3能夠抑制肺癌增殖，促進凋亡，抑制血管生成和轉移。此外，Rg3能夠增加多種化療藥物及靶向藥物的藥物敏感性。然而，Rg3是否能夠通過FUT4發(fā)揮抗

7、肺癌效果；是否能夠提高吉非替尼抗肺癌的療效還不清楚。本研究旨在探討人參皂苷 Rg3的抗肺癌機制以及是否能夠增加吉非替尼抗肺癌的藥物敏感性。
　　二、實驗方法：
　　1、收集大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院存檔的石蠟組織標本且臨床資料完整的非小細胞肺癌患者56例，正常石蠟組織標本35例，新鮮肺癌組織及正常肺組織10例。采用免疫組化及Western blot方法測定所有病理標本中及新鮮組織中FUT4的表達情況。分析FUT4與患者臨床病理

8、特征的相關性。應用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義；
　　2、采用脂質(zhì)體瞬時轉染技術將 FUT4的shRNA轉染至人肺癌細胞中，下調(diào)FUT4的表達；
　　3、采用ELISA方法檢測p-JAK2/JAK2的表達；
　　4、采用 Real-time PCR方法檢測FUT4、Snail、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin基因的表達；
　　5、采用Weste

9、rn blot方法檢測FUT4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、UEA、LeY、PARP1/2、Caspase3、Caspase8、Caspase9、EGFR/MAPK、NF-κB和JAK2/STAT3信號通路等相關蛋白的表達；
　　6、采用免疫熒光方法檢測FUT4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和LeY基因的表達；
　　7、采用免疫組化方法

10、檢測FUT4、N-cadherin、E-cadherin、P-EGFR、P-JAK2和Caspase3的表達；
　　8、采用CCK-8方法檢測細胞活性；
　　9、采用細胞克隆形成實驗分析細胞增殖能力；
　　10、采用流式細胞儀分析細胞凋亡。
　　三、結果：
　　(一) FUT4在肺癌中表達及其與EMT相關性的研究
　　1、FUT4在肺癌組織中比正常組織中表達高；
　　2、FUT4高表達與淋巴結轉

11、移及腫瘤分期有統(tǒng)計學意義；
　　3、FUT4表達高低與N-cadherin的表達一致。
　　(二)人參皂苷Rg3通過下調(diào)FUT4抑制非小細胞肺癌的EMT及侵襲的研究
　　1、Rg3能夠有效抑制肺癌的遷移、侵襲；
　　2、Rg3抑制肺癌的EMT呈時間、劑量依賴性；
　　3、Rg3降低FUT4的表達呈時間、劑量依賴性；
　　4、下調(diào)FUT4的表達明顯抑制A549細胞的EMT；
　　5、下調(diào)FUT4的

12、表達降低LeY的合成，抑制EGFR的激活進而阻斷其下游MAPK和NF-kB通路的激活；
　　6、Rg3在體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤的生長和EMT及腫瘤結節(jié)在肺內(nèi)轉移。
　　(三)人參皂苷Rg3通過抑制JAK2/STAT3通路增加吉非替尼治療肺癌敏感性的研究
　　1、Rg3抑制人肺癌細胞A549、H1299、H358和H1975的增殖；
　　2、Rg3明顯抑制JAK2/STAT3信號通路；
　　3、吉非替尼引起JAK2

13、/STAT3信號通路激活；
　　4、JAK2抑制劑TG101348能夠提高吉非替尼抑制肺癌的增殖的療效；
　　5、Rg3通過抑制JAK2/STAT3通路提高吉非替尼抑制增殖、誘導凋亡的抗肺癌效應；
　　6、Rg3在體內(nèi)增強吉非替尼抑制肺癌移植瘤生長的抗腫瘤效應。
　　四、結論：
　　(一) FUT4在肺癌中表達及其與EMT相關性的研究
　　1、FUT4在肺癌中高表達；
　　2、FUT4高表達與淋

14、巴結轉移和腫瘤分期有關；
　　3、FUT4表達與EMT呈正相關。
　　(二)人參皂苷Rg3通過下調(diào)FUT4抑制非小細胞肺癌的EMT及侵襲的研究
　　1、FUT4是Rg3的一個作用靶點；
　　2、Rg3抑制肺癌的遷移、侵襲和EMT與下調(diào)FUT4/LeY有關；
　　3、Rg3抑制肺癌EMT通過下調(diào)FUT4/LeY表達，抑制EGFR的激活及阻斷其下游的MAPK和NF-κB信號通路。
　　(三)人參皂苷 Rg