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文檔簡介
1、背景:
結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率居所有惡性腫瘤第三位,死亡率居所有惡性腫瘤第二位。人參皂苷 Rg3是由人參中提取的活性成分,其可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,并促進腫瘤細胞凋亡。WEE1蛋白是調(diào)控細胞周期G2檢查點的重要基因,其表達變化可影響DNA損傷藥物順鉑、紫杉醇、5-氟尿嘧啶等藥物對細胞的殺傷作用。在胃癌和卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn),人參皂苷可協(xié)同增敏順鉑和5-氟尿嘧啶對細胞的增殖抑制效應(yīng)。然而,人參皂苷 Rg
2、3、DNA損傷藥物和WEE1蛋白之間的作用并未見相關(guān)報道,本研究主要探討三者之間的相互關(guān)系,探討人參皂苷Rg3增敏DNA損傷藥物的相關(guān)分子機制。
第一部分人參皂苷Rg3通過抑制WEE1激酶表達增敏結(jié)腸癌對DNA損傷藥物敏感性的機制研究
研究目的:
探討人參皂苷Rg3是否可影響結(jié)腸癌細胞對DNA損傷藥物順鉑和5-氟尿嘧啶的增殖抑制效應(yīng)及其機制。
研究方法
1.為了探討人參皂苷Rg3聯(lián)合DN
3、A損傷藥物順鉑或5-氟尿嘧啶對WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞增殖活性的影響。應(yīng)用CCK-8細胞增殖活性檢測法,檢測不同濃度人參皂苷Rg3聯(lián)合不同濃度DNA損傷藥物順鉑或5-氟尿嘧啶干預(yù) WiDr、SW948和COLO205三株結(jié)腸癌細胞后對其細胞增殖活性的影響。
2.為了探討人參皂苷 Rg3影響結(jié)腸癌細胞增殖活性的潛在機制。應(yīng)用qRT-PCR法檢測不同濃度人參皂苷Rg3干預(yù)相同時間和相同濃度人參皂苷Rg3干預(yù)
4、不同時間后結(jié)腸癌細胞內(nèi)WEE1的表達水平變化。
3.為了探討WEE1過表達在人參皂苷Rg3影響結(jié)腸癌細胞對DNA損傷藥物順鉑和5-氟尿嘧啶敏感性過程中的作用。首先應(yīng)用質(zhì)粒過表達技術(shù)對WiDr,SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞進行WEE1過表達,并應(yīng)用qRT-PCR法檢測過表達程度;其次應(yīng)用CCK-8細胞增殖活性檢測法檢測10μM/L順鉑+75μM/L人參皂苷Rg3+不同pcDNA-WEE1濃度和3μM/L5-氟尿嘧啶+5
5、0μM/L人參皂苷Rg3+不同pcDNA-WEE1濃度等處理對于結(jié)腸癌細胞增殖活力的影響。
結(jié)果
1.順鉑和5-氟尿嘧啶對于結(jié)腸癌細胞WiDr、SW948和COLO205等增殖活力的抑制成濃度依賴性增加;隨著應(yīng)用人參皂苷Rg3濃度(0μM/L、25μM/L、50μM/L、75μM/L)的增加,在應(yīng)用相同濃度順鉑或5-氟尿嘧啶的前提下,WiDr,SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞的增殖活力逐漸降低;
2.
6、應(yīng)用人參皂苷Rg3干預(yù)三株結(jié)腸癌細胞,隨著人參皂苷Rg3干預(yù)濃度(0μM/L、25μM/L、50μM/L、75μM/L和100μM/L)的增加,WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞中WEE1的表達明顯降低;應(yīng)用50μM/L人參皂苷Rg3干預(yù)三株結(jié)腸癌細胞,隨著人參皂苷Rg3干預(yù)時間(0 h、6 h、12 h、18 h和24 h)的增加,WiDr,SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞中WEE1的表達逐漸降低;
3.
7、應(yīng)用pcDNA-WEE1質(zhì)??稍谌杲Y(jié)腸癌細胞中成功上調(diào)WEE1的表達;在相同濃度順鉑(10μM/L)+人參皂苷 Rg3(75μM/L)干預(yù)的前提下,隨著pcDNA-WEE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度(10 ng、50 ng、100 ng、150 ng)的增加,WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞的增殖活力逐漸增加;在相同濃度5-氟尿嘧啶(3μM/L)+人參皂苷Rg3(50μM/L)干預(yù)的前提下,隨著pcDNA-WEE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度(10
8、ng、50 ng、100 ng、150 ng)的增加,WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細胞的增殖活力逐漸增加。
結(jié)論
1.人參皂苷Rg3可增敏DNA損傷藥物(順鉑和5-氟尿嘧啶)對結(jié)腸癌細胞增殖活力的抑制效應(yīng);
2.人參皂苷 Rg3對 WEE1表達的抑制效應(yīng)呈濃度依賴性和時間依賴性增加;
3.過表達WEE1可減弱人參皂苷Rg3增敏DNA損傷藥物(順鉑和5-氟尿嘧啶)對結(jié)腸癌細胞增殖活力
9、的抑制效應(yīng)。
第二部分 WEE1在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床病理意義分析研究目的
探討 WEE1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。
研究方法
1.為了探討WEE1在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達,應(yīng)用Western blot和qRT-PCR法檢測新鮮結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中WEE1的表達;
2.為了明確WEE1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理
10、資料的相關(guān)性。應(yīng)用卡方檢驗分析 WEE1蛋白的陰性表達和陽性表達與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移、血清 CEA水平、有無腹膜轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、M分期及 TNM分期等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;
3.為了探討WEE1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性,應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,以 Log-rank檢驗比較WEE1蛋白的陰性表達和陽性表達與
11、患者預(yù)后的相關(guān)性;應(yīng)用單因素和多因素 Cox回歸分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險因素。
研究結(jié)果
1.在33例結(jié)直腸癌患者病理標本中,18例患者的結(jié)直腸癌組織中,WEE1蛋白和mRNA呈高表達;而15例患者的結(jié)直腸癌組織中,WEE1蛋白和mRNA呈低表達;
2.免疫組織化學結(jié)果示,在142例患者的石蠟包埋結(jié)直腸癌組織中,WEE1蛋白在86例中呈陽性表達,在56例中呈陰性表達;
3. WEE1陽性表達
12、與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度(P=0.033)、N分期(P=0.005)、TNM分期(P=0.009)、Duke’s分期(P=0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.006)等參數(shù)有明顯相關(guān)性,結(jié)果具有統(tǒng)計學意義;
4.根據(jù)WEE1蛋白表達水平,將所有結(jié)直腸癌患者分為陽性表達組和陰性表達組,WEE1陽性表達組患者的平均生存時間明顯短于 WEE1陰性表達組;單因素分析結(jié)果示,腫瘤大?。℉R=0.5,95%置信區(qū)間0.263-0.949
13、,P=0.034)、TNM分期(HR=1.402,95%置信區(qū)間0.934-6.176,P=0.012)、M分期(HR=1.562,95%置信區(qū)間0.231-4.685,P=0.002)、肝轉(zhuǎn)移(HR=3.462,95%置信區(qū)間1.265-10.256,P=0.014)和WEE1表達(HR=7.608,95%置信區(qū)間3.019-19.185,P<0.001)是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險因素;多因素 Cox比例風險回歸模型結(jié)果示,TNM分
14、期(HR=2.899,95%置信區(qū)間2.072-8.056,P<0.001)和WEE1表達(HR=6.533,95%置信區(qū)間2.93-14.566,P<0.001)是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。
5.在I期結(jié)直腸癌患者中,WEE1的表達與患者OS和DFS并無明顯相關(guān)性,而在II期和III期結(jié)直腸癌患者患者中,WEE1陽性表達提示患者OS和DFS較差。
研究結(jié)論
WEE1在結(jié)直腸癌組織中呈高表達;其陽
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