人參皂苷Rg3通過抑制WEE1激酶表達(dá)增加結(jié)腸癌細(xì)胞對DNA損傷藥物的敏感性.pdf

1、背景：
　　結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤第三位，死亡率居所有惡性腫瘤第二位。人參皂苷 Rg3是由人參中提取的活性成分，其可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。WEE1蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期G2檢查點(diǎn)的重要基因，其表達(dá)變化可影響DNA損傷藥物順鉑、紫杉醇、5-氟尿嘧啶等藥物對細(xì)胞的殺傷作用。在胃癌和卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可協(xié)同增敏順鉑和5-氟尿嘧啶對細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)。然而，人參皂苷 Rg

2、3、DNA損傷藥物和WEE1蛋白之間的作用并未見相關(guān)報(bào)道，本研究主要探討三者之間的相互關(guān)系，探討人參皂苷Rg3增敏DNA損傷藥物的相關(guān)分子機(jī)制。
　　第一部分人參皂苷Rg3通過抑制WEE1激酶表達(dá)增敏結(jié)腸癌對DNA損傷藥物敏感性的機(jī)制研究
　　研究目的：
　　探討人參皂苷Rg3是否可影響結(jié)腸癌細(xì)胞對DNA損傷藥物順鉑和5-氟尿嘧啶的增殖抑制效應(yīng)及其機(jī)制。
　　研究方法
　　1.為了探討人參皂苷Rg3聯(lián)合DN

3、A損傷藥物順鉑或5-氟尿嘧啶對WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的影響。應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測法，檢測不同濃度人參皂苷Rg3聯(lián)合不同濃度DNA損傷藥物順鉑或5-氟尿嘧啶干預(yù) WiDr、SW948和COLO205三株結(jié)腸癌細(xì)胞后對其細(xì)胞增殖活性的影響。
　　2.為了探討人參皂苷 Rg3影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的潛在機(jī)制。應(yīng)用qRT-PCR法檢測不同濃度人參皂苷Rg3干預(yù)相同時(shí)間和相同濃度人參皂苷Rg3干預(yù)

4、不同時(shí)間后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)WEE1的表達(dá)水平變化。
　　3.為了探討WEE1過表達(dá)在人參皂苷Rg3影響結(jié)腸癌細(xì)胞對DNA損傷藥物順鉑和5-氟尿嘧啶敏感性過程中的作用。首先應(yīng)用質(zhì)粒過表達(dá)技術(shù)對WiDr，SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行WEE1過表達(dá)，并應(yīng)用qRT-PCR法檢測過表達(dá)程度；其次應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測法檢測10μM/L順鉑+75μM/L人參皂苷Rg3+不同pcDNA-WEE1濃度和3μM/L5-氟尿嘧啶+5

5、0μM/L人參皂苷Rg3+不同pcDNA-WEE1濃度等處理對于結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力的影響。
　　結(jié)果
　　1.順鉑和5-氟尿嘧啶對于結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr、SW948和COLO205等增殖活力的抑制成濃度依賴性增加；隨著應(yīng)用人參皂苷Rg3濃度（0μM/L、25μM/L、50μM/L、75μM/L）的增加，在應(yīng)用相同濃度順鉑或5-氟尿嘧啶的前提下，WiDr，SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活力逐漸降低；
　　2.

6、應(yīng)用人參皂苷Rg3干預(yù)三株結(jié)腸癌細(xì)胞，隨著人參皂苷Rg3干預(yù)濃度（0μM/L、25μM/L、50μM/L、75μM/L和100μM/L）的增加，WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞中WEE1的表達(dá)明顯降低；應(yīng)用50μM/L人參皂苷Rg3干預(yù)三株結(jié)腸癌細(xì)胞，隨著人參皂苷Rg3干預(yù)時(shí)間（0 h、6 h、12 h、18 h和24 h）的增加，WiDr，SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞中WEE1的表達(dá)逐漸降低；
　　3.

7、應(yīng)用pcDNA-WEE1質(zhì)?？稍谌杲Y(jié)腸癌細(xì)胞中成功上調(diào)WEE1的表達(dá)；在相同濃度順鉑（10μM/L）+人參皂苷 Rg3（75μM/L）干預(yù)的前提下，隨著pcDNA-WEE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度（10 ng、50 ng、100 ng、150 ng）的增加，WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活力逐漸增加；在相同濃度5-氟尿嘧啶（3μM/L）+人參皂苷Rg3（50μM/L）干預(yù)的前提下，隨著pcDNA-WEE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度（10

8、ng、50 ng、100 ng、150 ng）的增加，WiDr、SW948和COLO205等結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活力逐漸增加。
　　結(jié)論
　　1.人參皂苷Rg3可增敏DNA損傷藥物（順鉑和5-氟尿嘧啶）對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力的抑制效應(yīng)；
　　2.人參皂苷 Rg3對 WEE1表達(dá)的抑制效應(yīng)呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性增加；
　　3.過表達(dá)WEE1可減弱人參皂苷Rg3增敏DNA損傷藥物（順鉑和5-氟尿嘧啶）對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力

9、的抑制效應(yīng)。
　　第二部分 WEE1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床病理意義分析研究目的
　　探討 WEE1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。
　　研究方法
　　1.為了探討WEE1在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，應(yīng)用Western blot和qRT-PCR法檢測新鮮結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中WEE1的表達(dá)；
　　2.為了明確WEE1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理

10、資料的相關(guān)性。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析 WEE1蛋白的陰性表達(dá)和陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血清 CEA水平、有無腹膜轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、M分期及 TNM分期等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性；
　　3.為了探討WEE1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性，應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以 Log-rank檢驗(yàn)比較WEE1蛋白的陰性表達(dá)和陽性表達(dá)與

11、患者預(yù)后的相關(guān)性；應(yīng)用單因素和多因素 Cox回歸分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。
　　研究結(jié)果
　　1.在33例結(jié)直腸癌患者病理標(biāo)本中，18例患者的結(jié)直腸癌組織中，WEE1蛋白和mRNA呈高表達(dá)；而15例患者的結(jié)直腸癌組織中，WEE1蛋白和mRNA呈低表達(dá)；
　　2.免疫組織化學(xué)結(jié)果示，在142例患者的石蠟包埋結(jié)直腸癌組織中，WEE1蛋白在86例中呈陽性表達(dá)，在56例中呈陰性表達(dá)；
　　3. WEE1陽性表達(dá)

12、與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度（P=0.033）、N分期（P=0.005）、TNM分期（P=0.009）、Duke’s分期（P=0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.006）等參數(shù)有明顯相關(guān)性，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　4.根據(jù)WEE1蛋白表達(dá)水平，將所有結(jié)直腸癌患者分為陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組，WEE1陽性表達(dá)組患者的平均生存時(shí)間明顯短于 WEE1陰性表達(dá)組；單因素分析結(jié)果示，腫瘤大小（HR=0.5,95％置信區(qū)間0.263-0.949

13、，P=0.034）、TNM分期（HR=1.402,95%置信區(qū)間0.934-6.176，P=0.012）、M分期（HR=1.562，95%置信區(qū)間0.231-4.685，P=0.002）、肝轉(zhuǎn)移（HR=3.462,95%置信區(qū)間1.265-10.256，P=0.014）和WEE1表達(dá)（HR=7.608,95%置信區(qū)間3.019-19.185，P＜0.001）是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素；多因素 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果示，TNM分

14、期（HR=2.899,95%置信區(qū)間2.072-8.056，P＜0.001）和WEE1表達(dá)（HR=6.533,95%置信區(qū)間2.93-14.566，P＜0.001）是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　5.在I期結(jié)直腸癌患者中，WEE1的表達(dá)與患者OS和DFS并無明顯相關(guān)性，而在II期和III期結(jié)直腸癌患者患者中，WEE1陽性表達(dá)提示患者OS和DFS較差。
　　研究結(jié)論
　　WEE1在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)；其陽