己酮可可堿對大鼠急性胰腺炎治療作用及其機制的研究.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的急腹癥之一，常合并各種并發(fā)癥，病死率高。引起AP的病因較多，目前，臨床和實驗研究證明，細胞因子和氧化應(yīng)激在AP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 與AP發(fā)生發(fā)展有關(guān)的細胞因子包括白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間黏附因子-1(ICAM-1)等。細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AP的病理生理變化及引起的多臟器功能受損中發(fā)揮重要作用。如果應(yīng)用細胞因子抑制劑阻

2、斷細胞因子介導(dǎo)的級聯(lián)炎癥反應(yīng)，可以減輕胰腺炎的損傷和全身炎癥反應(yīng)。TNF-α是在AP發(fā)病后較早出現(xiàn)的促炎細胞因子，在AP發(fā)病后短時間內(nèi)迅速升高。TNF-α可誘導(dǎo)白細胞介素．6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)產(chǎn)生，并能刺激一氧化氮和氧自由基的生成，可促使白細胞趨化、黏附，還可使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，損傷微循環(huán)。 己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)是甲基黃嘌呤的衍生物，具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集的作用，

3、已應(yīng)用于臨床多個領(lǐng)域，尤其被廣泛用于治療腦血管疾病。PTX是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，能阻斷環(huán)磷酸腺苷(cAMP)轉(zhuǎn)變?yōu)锳MP，引起細胞內(nèi)cAMP濃度升高，從而抑制細胞內(nèi)多種物質(zhì)mRNA．的表達，如TNF-α、iNOS、IFN-7、IL-10等。應(yīng)用PTX可阻斷細胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，進一步抑制氧自由基的生成，可以減輕胰腺炎癥反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是細胞內(nèi)的

4、一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞外信號入核的過程中發(fā)揮重要作用。MAPK有4個亞家族：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38 MAPK)和巨絲裂原活化蛋白激酶1(BMK1/ERK5)。許多學(xué)者已證實，JNK、p38 MAPK在胰腺損傷及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。JNK、p38 MAPK可被脂多糖(LPS)、TNF-α、IL-1等刺激因子激活，活化的JNK、p38 MAPK

5、轉(zhuǎn)移入核，進一步激活核轉(zhuǎn)錄因子，從而參與細胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等生物學(xué)過程。一些文獻報道了p38 MAPK和JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在.AP發(fā)生發(fā)展中的作用機制，通過抑制p38 MAPK和JNK的激活、減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生而改善AP的病變程度。 有研究提出胰腺腺泡細胞的凋亡發(fā)生率與AP病變的嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)，誘導(dǎo)細胞凋亡可減輕AP的嚴(yán)重程度，但過度誘導(dǎo)凋亡會加重胰腺的損害。那么通過誘導(dǎo)或抑制腺泡細胞的凋亡，就可以調(diào)控AP的嚴(yán)重程度。

6、 一些研究表明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與了胰腺細胞的凋亡。因此阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后可抑制炎性因子的表達，使胰腺細胞凋亡發(fā)生改變，可能影響AP病程的進展。 目的： 本研究采用3.5％牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)大鼠AP模型，并給予PTX干預(yù)，通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，觀察TNF-α、ICAM-1和胰腺腺泡細胞凋亡的變化，探討PTX對AP的保護作用及其機制。 方法： 1 實驗動物模型的制備：選取清潔健康wistar雄性大鼠

7、(120只)，實驗前24小時開始禁食，自由飲水。10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，上腹正中切口進入腹腔，顯露胰膽管，在近肝門處用無創(chuàng)血管夾夾閉胰膽管后，用4號加工鈍頭頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2ml/min速度注入3.5％?；悄懰徕c(0.1ml/100g)，推藥后用無創(chuàng)血管夾夾住膽胰管入十二指腸處，觀察10min，去除血管夾，關(guān)腹。 2 實驗動物分組 1、)假手術(shù)組(SO組)：開腹翻動

8、十二指腸并觸摸胰腺3次(n=30)。 2)急性胰腺炎組(AP組)：3.5％?；悄懰徕c誘導(dǎo)的AP模型(n=30)。 3)生理鹽水對照組(AP-NS組)：制造急性胰腺炎模型成功后，腹腔內(nèi)注射同等劑量的生理鹽水(n=30)。 4)急性胰腺炎組+己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)組(AP-PTX組)：制造急性胰腺炎模型成功后，腹腔內(nèi)注射PTX(50mg/kg)(n=30)。 另選取6只大鼠作為正常

9、組，處死后留取胰腺組織用于檢測p-p38 MAPK和p-JNKl的表達。 3 標(biāo)本采集：按1h，3h，6h，9h，12h時間點，分別處死大鼠留取血液和胰腺組織，每時間點6只大鼠。 4 測定指標(biāo)及方法 1)血淀粉酶測定：采用生化自動分析儀測定。 2)胰腺炎組織病理學(xué)：HE染色，光鏡下觀察胰腺組織病理變化。 3)血清細胞因子測定：采用ELISA方法測定血清TNF-α、ICAM-1的表達。 4

10、)p38 MAPK及JNK1活性的測定：采用Western blotting方法測定，分別檢測p-JNKl、p-p38 MAPK的表達。 5)胰腺細胞凋亡的檢測：TUNEL方法檢測胰腺細胞的凋亡率。 結(jié)果 1 血清淀粉酶水平SO組血清淀粉酶水平在各時間點無顯著性變化，均低于其他組(P<0.01)，AP組、AP-NS組及AP-PTX組血清淀粉酶水平隨時間的延長而逐漸增高。其中AP-PTX組各時間點血清淀粉酶水平均顯

11、著低于AP組和.AP-NS組(P<0.01)。 2 胰腺組織病理學(xué)結(jié)果SO組各時間點胰腺輕度水腫，光鏡下，除了局限間質(zhì)水腫，胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整、無壞死、間質(zhì)水腫和炎癥細胞浸潤。AP-NS組可見血性腹水，胰腺有壞死灶，光鏡下可見胰腺間質(zhì)水腫，小葉間隙增大，殘余腺泡腫脹；并可見彌漫性出血壞死和腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞，周圍有大量的嗜中性粒細胞及單核細胞等炎癥細胞浸潤。AP-PTX組腹水減少，光鏡下胰腺組織水腫、出血不明顯，腺泡細

12、胞變性和腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，炎癥細胞浸潤減少。 3 血清TNF-α、ICAM-1含量在SO組，血清TNF-α和ICAM-1水平在各時間點無顯著性變化，均低于其他組(P<0.01)；在AP組、AP-NS組及AP-PTX組，血清TNF-α水平在造模后逐漸升高并在6h達到高峰，各組峰值分別為(174.84±7.87)ng/ml、(179.56±6.79)ng/ml和(163.46±7.51)ng/ml。AP組、AP-NS組及AP

13、-PTX組血清ICAM-1水平隨時間的延長而逐漸升高。AP-PTX組各時間點TNF-α水平均顯著低于AP組和AP-NS組(P<0.05)，除1h外AP-PTX組其他時間點ICAM-1水平顯著低于AP組和AP-NS組(P<0.05)。 4 p-p38 MAPK和P-JNK1的表達 4.1 p-p38 MAPK的表達Western blotting顯示，在38kD的位置出現(xiàn)一條雜交帶，43kD的位置出現(xiàn)內(nèi)參照β-actin

14、的特異條帶。經(jīng)光密度測定分析結(jié)果：AP組1h P-p38 MAPK的積分光密度值(IOD)顯著升高，3h達到峰值(0.9975±0.005)。與SO組的IOD值(0.8933±0.03215)相比，AP組的IOD值升高(0.9803±0.02001，P<0.0 1)。與AP-NS組IOD值(0.9953±0.0808)相比，AP-PTX組P-p38MAPK的IOD值明顯降低(0.8883±0.01767，P<0.01)。 4.2

15、 P-JNK1的表達Western blotting顯示，在46kD的位置出現(xiàn)一條雜交帶，43kD的位置出現(xiàn)內(nèi)參照β-actin的特異條帶。光密度測定分析結(jié)果：AP組1h P-JNK1的IOD值顯著升高至峰值(0.9343±0.03151)。與SO組IOD值(0.6467±0.01528)相比，AP組P-JNK1的IOD值升高(0.9100±0.06083，P<0.01)。與AP-NS組IOD值(0.9367±0.02082)相比，AP

16、-PTX組P-JNK1的IOD值降低(0.6267±0.02309，P<0.01)。 5 胰腺腺泡細胞凋亡在SO組，可見極少量胰腺腺泡細胞凋亡。AP組造模后1h、3h、6h可見胰腺腺泡細胞凋亡，造模后9h、12h可見胰腺腺泡細胞壞死，少量胰腺腺泡細胞凋亡。與AP組、AP-NS組各時間點相比，AP-PTX組胰腺腺泡細胞凋亡增多，凋亡指數(shù)增加(P<0.05)。 結(jié)論： 1 在?；悄懰徕c誘導(dǎo)的AP大鼠中，血清淀粉酶升高

17、，胰腺組織出現(xiàn)水腫、炎性浸潤、腺泡出血壞死等病理學(xué)改變。給予PTX治療后血清淀粉酶降低，胰腺病理學(xué)改變明顯減輕。 2 在AP大鼠，血清TNF-α水平隨時間的延長逐漸升高并在6h達到高峰；ICAM一1水平也隨時間的延長而逐漸升高。在AP-PTX組，TNF-α和ICAM-1水平均顯著低于AP組和AP-NS組，提示PTX可明顯抑制這兩種炎性因子的釋放。 3 AP大鼠胰腺組織p-p38 MAPK、p-JNK1表達明顯升高，表明M

18、APK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。PTX可抑制胰腺組織p-p38 MAPK、p-JNK1的表達。 4 在AP早期即見有較多的胰腺腺泡細胞凋亡，PTX能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，誘導(dǎo)細胞凋亡可以減輕AP的病變程度。 5 本研究表明，PTX在AP損傷中有保護作用，這種保護作用可能與抑制MAPK通路(p38 MAPK和JNK1)有關(guān)，由于MARK通路的抑制，減少炎性細胞因子(TNF-α和ICAM-1)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞凋亡。