三種有機磷水解酶的酶學(xué)性質(zhì)比較及OPH定向進化研究.pdf

1、乙基對硫磷水解酶（OPH）是第一個研究得比較透徹的有機磷水解酶，與本實驗室克隆表達的甲基對硫磷水解酶MPH是完全不同的蛋白，它們的相似性小于20％。為比較甲基對硫磷水解酶（MPH）和乙基對硫磷水解酶（OPH）的異同，本文選取來源于乙基對硫磷降解菌Flavobacterium sp.ATCC27551中的乙基對硫磷水解酶基因（opd）、及甲基對硫磷降解菌Plesiomonas sp.M6和Pseudomonas putida DLL-E4

2、中克隆的甲基對硫磷水解酶基因（mpd）為研究對象，構(gòu)建了表達載體pET29a-mpd-dsp-his（M6）、pET29a-mpd-dsp-his（DLL-E4）、pET29a-opd-dsp-his（Flavoba cterium sp.），在Escheri-chia coli BL21（DE3）中得表達出帶有His-Tag的MPH和OPH。本研究首先確定了酶促反應(yīng)的終止條件：先用濃鹽酸終止，再加pH10的Glycine-NaOH緩沖

3、液顯色，大大減少了酶活測定時的誤差。其次，對MPH和OPH的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。MPH（M6）、MPH（DLL-E4）和OPH的最適溫度分別為：30℃、35℃和40℃，且三個酶在4℃時的穩(wěn)定性最高。MPH（M6）、MPH（DLL-E4）和OPH的最適pH分別為pH8.5、pH9.0、pH8.5，且在pH7.5-pH8.5的范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定性都較高（MPH（M6）、MPH（DLL-E4）和OPH分別在pH7.5、pH8.0、pH8.5的緩沖

4、液中放置3小時后剩余酶活都能達到95％左右）。Cu2+和Fe3+對MPH（M6）的酶活有較好的促進作用，Ca2+和Zn2+對MPH（DLL-E4）的酶活有較好的促進作用，Co2+、Ni2+和Zn2+對OPH的酶活有較好的促進作用，較高濃度的EDTA·2Na+（10mM）對三個酶都有較大程度的抑制作用；Co2+、Cd2+和Li+對MPH（M6）的酶活有一定的抑制作用，且Co2+和Cd2+對MPH（DLL-E4）的酶活也有抑制作用，Cu2+

5、對 OPH的酶活有一定的抑制作用；此外，較高濃度的咪唑（100mM）和NaCl（0.5M）對MPH和OPH的酶活有影響，應(yīng)在Ni-NTA親和層析后將其盡量透析掉。此外，我們確定了一組較好的酶長期保藏的方案：8mg/mL的粗酶與“84”等體積混合后再溶于15％NaCl和10％乙醇中（4℃放置三個月后酶活無損失），可將其應(yīng)用于加酶餐具洗潔精的生產(chǎn)中，具有很好的生產(chǎn)實踐意義。我們還對MPH和OPH的降解譜進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)三個酶的降解譜都比

6、較廣，其中OPH較MPH降解譜更廣，但三個酶都不能降解倍硫磷。鑒于倍硫磷的結(jié)構(gòu)和甲基對硫磷非常相似，我們通過Error-Prone PCR的方法對OPH定向進化，篩選到了一株能穩(wěn)定降解倍硫磷的突變株M3-Q6，在倍硫磷濃度為50mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃，150r·min-1振蕩培養(yǎng)72h，其對倍硫磷的降解率達50％；另外還篩選到五株對乙基對硫磷沒有降解能力的突變株；我們將這五株突變株進行了重組表達，驗證了其對乙基對硫磷確實沒