木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析及定向進(jìn)化.pdf

1、半纖維素是自然界中第二大可再生資源，人們對(duì)其組分最豐富的木聚糖的降解研究及其生物轉(zhuǎn)化技術(shù)探索方興未艾。在木聚糖降解酶系中內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶都是非常重要的糖苷水解酶。β-木糖苷酶已經(jīng)應(yīng)用于傳統(tǒng)工業(yè)工藝中。在養(yǎng)殖業(yè)，β-木糖苷酶可以改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高肉類的品質(zhì)。在食品工業(yè)，木糖苷酶一般用作浸漬酶，主要應(yīng)用于萃取和澄清果汁，提高品質(zhì)。在釀造工業(yè)，β-木糖苷酶可以降低啤酒和葡萄汁的粘稠度和渾濁度，提高過濾后的澄清度，提高酒的穩(wěn)定性和

2、香醇性。在造紙工業(yè)，β-木糖苷酶可以減少化學(xué)品的消耗。木糖苷酶與其它半纖維素酶一起具有很多潛在的應(yīng)用包括咖啡工藝，蔬菜浸漬，高纖維烘焙材料與顏料的制備，調(diào)味品，淀粉抽提，清潔劑工業(yè)以及抗菌和抗氧化的多糖活性藥物等。
　　 本文分別從深海嗜熱細(xì)菌嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)和真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中克隆了β-木糖苷酶(β-xylosidase)基

3、因，并在大腸桿菌DE3中表達(dá)、純化和研究其酶學(xué)性質(zhì)。研究結(jié)果如下。
　　 1.來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的β-木糖苷酶(gsxyn)基因全長(zhǎng)2118 bp，起始密碼子為ATG，終止子為TAA，GC含量為51.37％。gsxyn編碼705個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)pI為5.03，分子量為79.82 kDa。通過SignalP4.1 Server預(yù)測(cè)氨基酸序列沒有信號(hào)肽。通過BLAST比對(duì)，GSxyn屬于第52家族糖苷水解酶，催化氨基酸殘基為Glu

4、-335和Asp-495。將gsxyn基因克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1上，在大腸桿菌DE3中表達(dá)，然后純化和分析木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。GSxyn在pH5.5和70℃時(shí)酶活最高;在以對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(ρNPX)作為底物時(shí)，GSxyn的Km為0.48 mM，Vmax為27.54μmol/mg·min，kcat為36.63 s-1和kcat/Km為76.99 L/s·mmol。
　　 為了探索木糖苷酶的底物特異性，研究多

5、功能酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過木糖苷酶的定點(diǎn)突變(Y509E)引入了木聚糖酶的活性，并保持有原始的木糖苷酶活性。通過高效液相陰離子交換色譜層析(HPAEC)測(cè)定引入的木聚糖酶是水解酶。在這過程中分別研究了在突變之后木糖苷酶和木聚糖的酶學(xué)性質(zhì)。突變體Y509E的木糖苷酶(Y509Exyn)活性:Y509Exyn在pH5.5和60℃時(shí)酶活最高;在以對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(ρNPX)作為底物時(shí)，Y509Exyn的Km為0.51 mM，Vmax為1

6、5.52μmol/mg·min，kcat為20.64 s-1和kcat/Km為40.75 L/s·mmol。突變體Y509E的木聚糖酶(Y509Exyl)活性:Y509Exyl在pH6.5和50℃時(shí)酶活最高;在以山毛櫸木聚糖作為底物時(shí)，Y509Exyl的Km為5.10 mg/mL，Vmax為16.94μmol/mg·min，kcat為22.53s-1和kcat/Km為4.42 mL/s·mg。因此，這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明第52家族木糖苷酶可

7、以為一般構(gòu)建具有多催化功能的酶，特別是能夠降解工業(yè)上重要的復(fù)雜的物質(zhì)（如植物細(xì)胞壁）的糖苷水解酶，提供一個(gè)研究的平臺(tái)。
　　 2.來自煙曲霉的β-木糖苷酶(afc6xyn)基因全長(zhǎng)1595 bp，在第六染色體上，包含有一個(gè)內(nèi)含子。afc6xyn基因的ORF為1542 bp，起始密碼子為ATG，終止子為TAA，GC含量為51.62％。afc6xyn編碼513個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)pI為5.60，分子量為57.36 kDa。通過Signa

8、lP4.1 Server預(yù)測(cè)氨基酸序列沒有信號(hào)肽。通過BLAST比對(duì)，Afc6xyn屬于第43家族糖苷水解酶，催化氨基酸殘基為Asp-140和Glu-194。將afc6xyn基因克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1上，在大腸桿菌DE3中表達(dá)，然后純化和分析木糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)。Afc6xyn在pH6.0和50℃時(shí)酶活最高;在以對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(ρNPX)作為底物時(shí)，Afc6xyn的Km為0.56 mM，Vmax為0.25μmol/m