阿特拉津脫氯水解酶(TrzN)的定向進(jìn)化.pdf

1、TrzN是一種新的阿特拉津脫氯水解酶,它與AtzA具有相同的作用,但具有更廣泛的底物譜。然而,TrzN在表達(dá)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí),容易形成不具有活力的包涵體。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)定向進(jìn)化的方法,提高TrzN的可溶性表達(dá)及其酶活性。
　　 定向進(jìn)化的兩個(gè)關(guān)鍵性步驟是建立分子的多樣性文庫(kù)和高通量篩選體系。本實(shí)驗(yàn)采用Error-Prone PCR來(lái)建立分子的多樣性,以pRBB作為載體建立突變體文庫(kù)。根據(jù)TrzN水解阿特拉津產(chǎn)生羥基阿特拉津在平板

2、上能產(chǎn)生水解圈的特性建立了高通量的篩選體系。突變菌株在37℃下過(guò)夜培養(yǎng),篩選水解圈/菌落克隆直徑大于野生型菌的克隆,作為研究對(duì)象進(jìn)行發(fā)酵液上清和純酶水平上的進(jìn)一步鑒定。最終我們篩選到一株酶活性提高2.5倍且可溶性表達(dá)提高的突變株,命名為MuA-55,測(cè)序結(jié)果表明,MuA-55有三處堿基替換,其中一處(G568A)引起Gly190Ser,另外兩處的無(wú)義突變使得密碼子使用頻率由低變高,甘氨酸與絲氨酸結(jié)構(gòu)性狀十分相似,絲氨酸在側(cè)鏈上比甘氨酸多

3、一個(gè)羥基,這使得蛋白的親水性增強(qiáng),有助于可溶性的表達(dá)。我們還得到一株名為MuE-118,其有5處堿基替換,其中一處與MuA-55相同(G568A),也引起Glv190Ser,其余四處為無(wú)義突變,但是密碼子使用頻率的改變沒(méi)有規(guī)律性可尋,其酶活性沒(méi)有提高,反而降低了。
　　 為了解釋MuA-55與MuE-118出現(xiàn)的性狀差異現(xiàn)象,我們對(duì)兩者進(jìn)行了回復(fù)突變、定點(diǎn)突變扣飽和突變,結(jié)果顯示,兩者性狀差異現(xiàn)象產(chǎn)生的原因既有氨基酸突變的因素也

4、有密碼子使用頻率改變的因素。我們還對(duì)突變文庫(kù)中一株不具活性的突變株MuF-212進(jìn)行了回復(fù)突變,發(fā)現(xiàn)第126位氨基酸的變化對(duì)酶活性的喪失具有決定性的作用,該位點(diǎn)位于活性中心附近。
　　 為了進(jìn)一步解釋MuA-55與MuE-118出現(xiàn)的性狀差異現(xiàn)象,我們對(duì)MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步比較,結(jié)果顯示,它們的最適pH值均為7.0,最適溫度均為42℃.我們通過(guò)比較三者的最適pH范圍,發(fā)現(xiàn)190位