新型β-瓊膠酶AgaB的定向進化.pdf

1、瓊膠酶AgaB是本試驗室從海洋假別單胞菌CY24中克隆得到的一個新穎的胞外瓊膠酶。研究表明AgaB是一個結構和功能全新的β-瓊膠酶，降解瓊脂糖的主要產物為新瓊八糖和十糖，最小底物為十二糖，作用機制為倒位型，在家族劃分上該酶不屬于任何一個已知的糖苷水解酶家族，這些都不同于已發(fā)現的其它瓊膠酶。AgaB結構上的新穎性和功能上的特異性決定了它在工業(yè)和藥用方面擁有潛在的應用價值。但是AgaB較低的溫度穩(wěn)定性(在高于35℃的情況下容易失去酶的活性)

2、限制了它在工業(yè)上的更大規(guī)模的應用。實驗室前期工作建立了耐熱性明顯提高的突變株M446，但其催化活性相比于野生型下降了20％。本論文旨在通過定向進化的方法，在保持M446耐熱性的前提下提高其催化活性。 定向進化的兩個關鍵步驟是建立分子的多樣性文庫和高通量篩選體系。本文采用易錯PCR和化學誘變來建立分子的多樣性，以組成型表達載體pBS-ks(sv)作為載體建立突變體文庫。易錯PCR引起的堿基突變多發(fā)生在胸腺嘧啶和腺嘌呤位點，而化學誘

3、變劑甲基磺酸乙酯主要引起鳥嘌呤位點的突變，在一定程度上彌補了易錯PCR的不足。根據瓊膠酶水解瓊膠引起瓊膠液化在平板上產生透明水解圈，而且相對酶活較高的突變株在平板上形成較大的水解圈的特性建立了高通量篩選體系。突變菌株在37℃下過夜培養(yǎng)，篩選水解圈/菌落克隆直徑大于野生型菌的克隆，作為研究對象進行發(fā)酵液上清和純酶水平上的進一步鑒定。最終我們獲得了一個熱穩(wěn)定性和產物性質沒有改變而比活力為M446 3倍的突變株，命名為M117。測序結果表明，

4、M117發(fā)生了四處堿基替代，其中兩處引起了氨基酸替代，分別是Arg9→Lys，Ilell 1→Val，另兩處為無義突變。其中第9位的氨基酸突變存在于信號肽區(qū)域，該區(qū)域在蛋白質跨膜轉運的時候被切除，對成熟酶的比活力沒有影響，由此，可以推斷引起突變株M117比活力提高的主要原因是第111位氨基酸的突變。 為了推測突變株M117催化活性提高的機制，我們分別測定了M117與M446的動力學常數，結果表明，突變株M117的K<,m>值比M

5、446降低了14倍，而其K<,cat>值變化不明顯。由此可以推斷，突變株M117催化活性提高的主要原因是酶與底物的結合能力增強。實驗中發(fā)現的氨基酸替代為纈氨酸替代了異亮氨酸，二者均 為疏水性氨基酸，但是纈氨酸的側鏈基團比異亮氨酸的小，推測第111位的氨基酸可能位于底物結合位點附近或者屬于底物結合位點的一部分，而短的側鏈基團對底物進入催化腔的空間位阻比較小，有利于底物與底物結合位點的結合。另一方面，因為異亮氨酸與纈氨酸的性質比較類