鹵醇脫鹵酶HheA表達(dá)優(yōu)化及定向進(jìn)化.pdf

1、在目前已知序列的六種鹵醇脫鹵酶中，根據(jù)它們的氨基酸序列相似性把它們分為A，B和C三種。其中來源于放射性土壤桿菌的鹵醇脫鹵酶HheC已被深入研究，而對(duì)于A類和B類的了解甚少。鑒于HheA和HheC底物特異性和立體選擇性上的不同，對(duì)HheA的改造以擴(kuò)大其底物范圍或增強(qiáng)立體選擇性，都可以使其在環(huán)境、醫(yī)藥、工業(yè)和農(nóng)業(yè)中發(fā)揮很好的應(yīng)用。因此，本文主要從以下三方面展開工作：
　　首先，酶的體外高效表達(dá)和純化是開展上述研究的基礎(chǔ)，而 HheA體

2、外重組表達(dá)水平僅為HheC的三分之一，本文在系統(tǒng)分析影響鹵醇脫鹵酶HheA表達(dá)的因素后，確定了N端+2位點(diǎn)密碼子優(yōu)化方法，使鹵醇脫鹵酶HheA的表達(dá)量較野生態(tài)提高了4倍，在此基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化了純化步驟，純化后得率為野生態(tài)的8倍。
　　第二，研究發(fā)現(xiàn)，利用鹵醇脫鹵酶生產(chǎn)β-羥基氰，β-硝基醇等具有光學(xué)純?chǔ)氯〈a(chǎn)物是鹵醇脫鹵酶的重要應(yīng)用之一，但目前實(shí)驗(yàn)室還缺乏一個(gè)有效的鹵醇脫鹵酶催化環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)篩選方法。實(shí)驗(yàn)通過反應(yīng)時(shí)間梯度和高碘酸鈉濃