shRNA-Smad3對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、第一部分：目的：構(gòu)建抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFB）Smad3基因表達(dá)的shRNA真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞中，獲得最佳轉(zhuǎn)染條件。 方法：用前期試驗(yàn)篩選出的一對(duì)最有效siRNA序列重組構(gòu)建Smad3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，按不同比例，時(shí)間及濃度，通過(guò)熒光顯微鏡判斷最佳轉(zhuǎn)染條件。采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。 結(jié)果：經(jīng)測(cè)序、凝膠電泳分析，成功構(gòu)建shRNA-Smad

2、3載體，shRNA-Smad3與脂質(zhì)體比例為1：1.8，在無(wú)血清條件下，轉(zhuǎn)染時(shí)間72h后轉(zhuǎn)染效率最高。原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)成功。 結(jié)論：脂質(zhì)體與DNA質(zhì)粒適當(dāng)?shù)谋壤龡l件下加入，在轉(zhuǎn)染較短的時(shí)間內(nèi)，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞可使目的基因獲得較高的轉(zhuǎn)染率，且細(xì)胞死亡最少。脂質(zhì)體是研究原代培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為較為理想的轉(zhuǎn)染方法。組織塊法可以得到瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。 第二部分： 目的

3、：研究shRNA-Smad3對(duì)KFB轉(zhuǎn)染到KFB后Smad3、Smad7及COLIA2表達(dá)的影響。 方法：通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將shRNA-Smad3轉(zhuǎn)染到瘢痕成纖維細(xì)胞，用免疫組化，RT-PCR及Western blotting的方法檢測(cè)Smad3、Smad7不同時(shí)間點(diǎn)（0～9d）表達(dá)的變化。 結(jié)果：①RT-PCR和Western blotting的結(jié)果證實(shí)Smad3 shRNA載體構(gòu)建成功。②轉(zhuǎn)染Smad3 shR