HPV16L1為載體的弓形蟲融合抗原ROP2-SAG1免疫優(yōu)勢(shì)表位的免疫效應(yīng)研究.pdf

1、目的:利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)、篩選和制備弓形蟲棒狀體蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)融合抗原免疫優(yōu)勢(shì)表位，分析以HPV16L1為載體攜帶融合抗原ROP2-SAG1優(yōu)勢(shì)表位的免疫效應(yīng)研究。
　　方法:基于弓形蟲融合抗原ROP2-SAG1氨基酸序列的基礎(chǔ)上，利用Protean軟件，分析ROP2-SAG1的親水性，表面可及性，抗原指數(shù)及柔韌性;利用PORTER程序，將易于形成優(yōu)勢(shì)表位的β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲處確定出來(lái)，而將不易于

2、形成表位的α螺旋、β折疊區(qū)域排除。利用ABCPred軟件初步預(yù)測(cè)ROP2-SAG1分子中B細(xì)胞表位，結(jié)合抗原指數(shù)計(jì)算方法預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。利用Internet網(wǎng)絡(luò)資源的SYFP EITHI等預(yù)測(cè)軟件，綜合預(yù)測(cè)、篩選HLA限制性T細(xì)胞表位，篩選既是優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，同時(shí)又包含優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位的優(yōu)勢(shì)表位。將優(yōu)勢(shì)表位相應(yīng)基因片段克隆至pET32a(+)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Roseta菌株（Roseta）中誘導(dǎo)表達(dá)，離子螯合親和層析柱(

3、Ni-NTA)純化表達(dá)產(chǎn)物，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定表達(dá)產(chǎn)物。以純化的優(yōu)勢(shì)表位表達(dá)產(chǎn)物為免疫原，皮下多點(diǎn)注射日本大耳白兔，設(shè)pET32a(+)載體蛋白和PBS為對(duì)照，以純化的優(yōu)勢(shì)表位蛋白作包被抗原ELISA法檢測(cè)第0、2和4周免疫兔血清中表位特異性抗體IgG的產(chǎn)生時(shí)間及效價(jià)，免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證免疫血清多克隆抗體的特異性。將優(yōu)勢(shì)表位相應(yīng)基因片段克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)即構(gòu)成弓形蟲融合抗原ROP

4、2-SAG1優(yōu)勢(shì)表位(即pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope），在此基礎(chǔ)上將HPV16L1基因片段克隆至pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）構(gòu)成pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）/HPV16L1。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒使用Lip-2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48h后，細(xì)胞提取RNA進(jìn)行RT-PCR,以及收集細(xì)胞裂解液上清，進(jìn)行West

5、ern blot鑒定，以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞48h后進(jìn)行免疫熒光鑒定其是否能夠在體外進(jìn)行特異性的表達(dá)。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過(guò)去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒大量抽提，通過(guò)肌肉注射免疫方式連續(xù)三周免疫BALB/c小鼠，pcDNA3.1(+)作為陰性對(duì)照。ELISA法檢測(cè)第0，2，4和6周免疫小鼠血清中表位特異性抗體IgG的產(chǎn)生時(shí)間及效價(jià)，以及特異性抗體IgG不同亞類之間引起Th反應(yīng)的區(qū)別。以及通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析技術(shù)(ELISPOT)檢測(cè)免

6、疫鼠脾細(xì)胞γ干擾素產(chǎn)生能力。
　　結(jié)果:1.通過(guò)生物信息學(xué)軟件成功預(yù)測(cè)和篩選出以柔性肽相連接的一個(gè)88氨基酸序列，包含3個(gè)B細(xì)胞表位，3個(gè)HLA-A*0201限制性、2個(gè)HLA-A*2402限制性、1個(gè)HLA-DRB1*1501限制性、2個(gè)HLA-DRB1*0401限制性、2個(gè)HLA-DRB1*0301限制性T細(xì)胞表位，Blast-P分析與人、小鼠蛋白序列無(wú)同源性。
　　2.在原核表達(dá)體系中獲得了30KD大小的弓形蟲融合抗原

7、ROP2-SAG1優(yōu)勢(shì)表位融合表達(dá)產(chǎn)物。純化的表位蛋白免疫大耳白兔，血清中可檢測(cè)到相應(yīng)的表位特異性抗體IgG，其抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，優(yōu)勢(shì)表位免疫組第2、4周兔血清抗體顯著高于載體pET32a(+)蛋白對(duì)照組（均P＜0.05），以第4周的免疫血清測(cè)定多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶40960。通過(guò)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)證實(shí)多克隆抗體針對(duì)優(yōu)勢(shì)表位具有良好的特異性。
　　3.重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)

8、證實(shí)重組質(zhì)粒能夠在體外細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄，通過(guò)Western blot，和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠在體外進(jìn)行特異性表達(dá)。
　　4.重組質(zhì)粒免疫小鼠后，免疫血清能夠檢測(cè)到相應(yīng)的表位特異性抗體IgG，其抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，優(yōu)勢(shì)表位免疫組以及優(yōu)勢(shì)表位/HPV16L1免疫組第2，4，6周小鼠血清抗體效價(jià)顯著高于pcDNA3.1(+)陰性質(zhì)粒對(duì)照組（均P＜0.05），且與優(yōu)勢(shì)表位免疫組相比優(yōu)勢(shì)表位/HPV16L1免疫組

9、的小鼠血清抗體效價(jià)顯著提高(P＜0.05)。以第4周的免疫血清測(cè)定多克隆抗體效價(jià)重組質(zhì)粒免疫組均可達(dá)1∶640。以pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）/HPV16L1重組質(zhì)粒免疫組為例進(jìn)行特異性抗體IgG亞類的測(cè)定，結(jié)果顯示從2周開(kāi)始特異性抗體IgG1顯著高于IgG2a(P＜0.05)，指出弓形蟲融合優(yōu)勢(shì)表位誘導(dǎo)機(jī)體主要產(chǎn)生Th1反應(yīng)。優(yōu)勢(shì)表位免疫鼠以及優(yōu)勢(shì)表位/HPV16L1免疫鼠脾細(xì)胞以3條特異性C

10、TL表位肽刺激后γ干擾素的產(chǎn)生水平分別為表位肽1（16.6±1.1/10萬(wàn)細(xì)胞，25.13±1.81/10萬(wàn)細(xì)胞）、表位肽2（21.6±1.7/10萬(wàn)細(xì)胞，31.86±1.1/10萬(wàn)細(xì)胞）、表位肽3（45.8±2.8/10萬(wàn)細(xì)胞，66.93±2.1/10萬(wàn)細(xì)胞），均顯著高于pcDNA3.1(+)陰性質(zhì)粒免疫對(duì)照組（均P＜0.05），且CTL表位聯(lián)合Th表位的組合肽刺激γ干擾素產(chǎn)生水平（表位肽3（45.8±2.8/10萬(wàn)細(xì)胞，66.93±

11、2.1/10萬(wàn)細(xì)胞）分別顯著高于兩組單獨(dú)的CTL表位肽刺激組（表位肽一16.6±1.1/10萬(wàn)細(xì)胞，25.13±1.81/10萬(wàn)細(xì)胞、表位肽二21.6±1.7/10萬(wàn)細(xì)胞，31.86±1.1/10萬(wàn)細(xì)胞）（均P＜0.05）。且與優(yōu)勢(shì)表位免疫組相比，優(yōu)勢(shì)表位/HPV16L1免疫組其特異性CTL表位肽刺激后γ干擾素的產(chǎn)生水平明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.預(yù)測(cè)和篩選到了弓形蟲免疫優(yōu)勢(shì)T、B細(xì)胞表位人工合成弓形蟲融合抗原ROP

12、2-SAG1優(yōu)勢(shì)表位(即/ROP2-SAG1(multiepitope))。
　　2.成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)/ROP2-SAG1（multiepitope），真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1(multiepitope)以及pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1(multiepitope)/HPV16L1
　　3.構(gòu)建成功的原核表達(dá)質(zhì)粒能夠在原核表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物