剛地弓形蟲ROP16-ROP18復(fù)合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplsma gondii）是世界上最常見的寄生蟲之一，屬于專性細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原生動(dòng)物寄生蟲，可寄生在人和各種脊椎動(dòng)物當(dāng)中。由于其感染人體可以造成懷孕婦女流產(chǎn)或死胎、胎兒畸形等疾病以及會(huì)使免疫缺陷患者產(chǎn)生腦炎、視網(wǎng)膜炎等，甚至潛在致命風(fēng)險(xiǎn)，使其備受關(guān)注。弓形蟲棒狀體蛋白(TgROPs)是弓形蟲入侵和發(fā)揮毒力的關(guān)鍵因子，在蟲體入侵宿主細(xì)胞與后續(xù)繁殖過程中有著重要作用，同時(shí)也是治療和預(yù)防弓形蟲病的藥物作用靶點(diǎn)及疫苗候選

2、組分。本研究利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了剛地弓形蟲ROP16和ROP18基因的復(fù)合基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16-ROP18，并將其轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。用該重組質(zhì)粒對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫后，通過對(duì)小鼠的相關(guān)免疫性指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定來評(píng)估其對(duì)動(dòng)物的免疫保護(hù)效果。
　　首先提取剛地弓形蟲速殖子總RNA，根據(jù)弓形蟲棒狀體蛋白16（TgROP16）與棒狀體蛋白18（TgROP18）基因的開放閱讀框架設(shè)計(jì)引物，采

3、用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法擴(kuò)增ROP16和ROP18基因，將二者分別連入至真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌（E.coli)XL1-Blue中。提取出陽性菌落質(zhì)粒后對(duì)其進(jìn)行PCR、酶切及基因測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示，TgROP16與TgROP18基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期相符，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。測(cè)序顯示獲得的TgROP16基因片段為2124

4、bp，獲得的TgROP18基因片段為1665bp，與GenBank已收錄的弓形蟲ROP16基因、ROP18基因序列一致性分別為99.8％與100％。結(jié)果表明克隆弓形蟲ROP16和ROP18基因成功。
　　隨后對(duì)載體pVAX1的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造，構(gòu)建載體pVAXA和pVAXB，PCR擴(kuò)增載體pVAXA中包含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表達(dá)單元片段，并將其連入載體pVAXB中，組建成具有兩個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)載體pVAXD。將質(zhì)

5、粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18中的目的基因ROP16、ROP18通過酶切連入載體pVAXD中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pVAXD-ROP16-ROP18，并對(duì)其構(gòu)建成功與否進(jìn)行PER及雙酶切驗(yàn)證。接下來用重組表達(dá)載體pVAXD-ROP16-ROP18轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)Hela細(xì)胞后利用RT-PCR法及間接免疫熒光法檢測(cè)兩個(gè)基因在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)載體pVAXD-ROP16-ROP18經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證構(gòu)建正確，RT-

6、PCR檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組β-肌動(dòng)蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物均與預(yù)期大小相符，實(shí)驗(yàn)組能夠擴(kuò)增出ROP16與ROP18基因，而對(duì)照組未擴(kuò)增出二者基因。間接免疫熒光法檢測(cè)顯示，重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18轉(zhuǎn)染組細(xì)胞可見綠色熒光，空質(zhì)粒及對(duì)照組無綠色熒光。表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16-ROP18，且實(shí)現(xiàn)了該質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)ROP16與ROP18基因。
　　最后采取堿裂解法制備重組表達(dá)載體，并將等量

7、的重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16-ROP18、pVAXD-ROP16+pVAXD-ROP18、pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18、pVAXD與生理鹽水通過肌肉注射的方式，以2周一次的間隔時(shí)間對(duì)BALB/c小鼠連續(xù)免疫3次。收集各組小鼠每次免疫前1日和末次免疫2周后的血清并測(cè)定當(dāng)中的特異性抗弓形蟲抗體水平及細(xì)胞因子含量;對(duì)末次免疫2周后各組小鼠進(jìn)行速殖子腹腔注射攻擊實(shí)驗(yàn)后評(píng)估各組的生存情況。結(jié)果顯示，各重組表達(dá)載體免疫組小鼠均