弓形蟲SAG1、MIC3單基因及SAG1-MIC3融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)致病性蟲，呈世界性分布，可引起人獸共患弓形蟲病，由法國學(xué)者Nicolle及Manceaux于1908年發(fā)現(xiàn)。蟲體呈弓形，故命名為弓形蟲。其發(fā)育全過程一般包括5種不同形態(tài)的階段，分別是滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊。其中滋養(yǎng)體、包囊、和卵囊與傳播和致病有關(guān)。人群感染雖多為隱性感染，但在免疫缺陷病人或孕婦，弓形蟲感染能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。有趣的是弓形蟲還能影響人的性

2、情，有學(xué)者指出：與沒有感染弓形蟲的人相比，感染弓形蟲的人的智商要偏低，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也表明弓形蟲與精神分裂癥有著某種聯(lián)系。家畜對(duì)弓形蟲易感，由弓形蟲感染引起的家畜的流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。貓、狗等寵物也易感染弓形蟲，是人類感染弓形蟲的重要傳染源。鑒于弓形蟲病對(duì)于人和家畜的破壞性作用所造成的經(jīng)濟(jì)損失，研制出具有免疫保護(hù)的疫苗迫在眉睫。 弓形蟲疫苗從死疫苗到減毒活疫苗，從直接提取蟲體的表面抗原到用基因工程技術(shù)提純單

3、價(jià)亞單位疫苗，再到現(xiàn)在針對(duì)生活史不同階段、聯(lián)合多種抗原組合的復(fù)合多價(jià)疫苗。速殖子是弓形蟲主要的致病階段，其表膜是宿主免疫防御系統(tǒng)識(shí)別和殺傷蟲體的主要作用部位，膜抗原對(duì)于疫苗防治方面有著重要意義。弓形蟲表膜P30抗原是迄今為止弓形蟲抗原研究最多的一種抗原，其基因代號(hào)為SAG1，P30蛋白是一種期特異性蛋白，只存在于弓形蟲速殖子期，而在緩殖子期、子孢子期不表達(dá)。P30蛋白約占蟲體蛋白的3％～5％，但誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體可占抗體總量的50％。在

4、急慢性病人血清中均能檢測(cè)出P30抗體。P30蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體都能限制人成纖維細(xì)胞的弓形蟲感染，說明抗體有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。P30抗原特異性的CD4T細(xì)胞能直接殺傷細(xì)胞外弓形蟲，對(duì)弓形蟲感染的腹腔巨噬細(xì)胞亦有細(xì)胞毒性。弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和入侵過程中伴隨著微線體內(nèi)容物的釋放[8]，其中MIC3基因編碼的MIC3蛋白是弓形蟲微線體內(nèi)容物的一種，在弓形蟲入侵宿主過程中起到連接弓形蟲和宿主的橋梁的作用[9].MIC3是一種大小為90

5、KD蛋白，參與蟲體與宿主細(xì)胞間的黏附過程，且在弓形蟲速殖子、緩殖子和子孢子三個(gè)感染階段都有表達(dá)。MIC3在早期能夠誘導(dǎo)小鼠和人分泌高效價(jià)的IgG抗體以及IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子，使機(jī)體產(chǎn)生高強(qiáng)度的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，作為疫苗候選分子具有巨大的潛力。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的弓形蟲SAG1及MIC3基因序列，在保證其開放讀碼框架正確的前提下，自行設(shè)計(jì)合成引物，在引物的5’末端分別加上適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切

6、位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得到SAG1及MIC3基因。鑒定基因片段后通過克隆技術(shù)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-SAG1-MIC3、pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC3。并對(duì)氨芐篩選的重組入外源基因的質(zhì)粒通過PCR、酶切和測(cè)序鑒定。采用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后Trizol提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一條鏈。管家基因β-actin PcR驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄，SAG1-MIC3、SA