弓形蟲SAG1、MIC3單基因及SAG1-MIC3融合基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會致病性蟲，呈世界性分布，可引起人獸共患弓形蟲病，由法國學者Nicolle及Manceaux于1908年發(fā)現(xiàn)。蟲體呈弓形，故命名為弓形蟲。其發(fā)育全過程一般包括5種不同形態(tài)的階段，分別是滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊。其中滋養(yǎng)體、包囊、和卵囊與傳播和致病有關(guān)。人群感染雖多為隱性感染，但在免疫缺陷病人或孕婦，弓形蟲感染能導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥。有趣的是弓形蟲還能影響人的性

2、情，有學者指出：與沒有感染弓形蟲的人相比，感染弓形蟲的人的智商要偏低，統(tǒng)計數(shù)據(jù)也表明弓形蟲與精神分裂癥有著某種聯(lián)系。家畜對弓形蟲易感，由弓形蟲感染引起的家畜的流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。貓、狗等寵物也易感染弓形蟲，是人類感染弓形蟲的重要傳染源。鑒于弓形蟲病對于人和家畜的破壞性作用所造成的經(jīng)濟損失，研制出具有免疫保護的疫苗迫在眉睫。 弓形蟲疫苗從死疫苗到減毒活疫苗，從直接提取蟲體的表面抗原到用基因工程技術(shù)提純單

3、價亞單位疫苗，再到現(xiàn)在針對生活史不同階段、聯(lián)合多種抗原組合的復(fù)合多價疫苗。速殖子是弓形蟲主要的致病階段，其表膜是宿主免疫防御系統(tǒng)識別和殺傷蟲體的主要作用部位，膜抗原對于疫苗防治方面有著重要意義。弓形蟲表膜P30抗原是迄今為止弓形蟲抗原研究最多的一種抗原，其基因代號為SAG1，P30蛋白是一種期特異性蛋白，只存在于弓形蟲速殖子期，而在緩殖子期、子孢子期不表達。P30蛋白約占蟲體蛋白的3％～5％，但誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體可占抗體總量的50％。在

4、急慢性病人血清中均能檢測出P30抗體。P30蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體都能限制人成纖維細胞的弓形蟲感染，說明抗體有相當?shù)谋Ｗo作用。P30抗原特異性的CD4T細胞能直接殺傷細胞外弓形蟲，對弓形蟲感染的腹腔巨噬細胞亦有細胞毒性。弓形蟲對宿主細胞的粘附和入侵過程中伴隨著微線體內(nèi)容物的釋放[8]，其中MIC3基因編碼的MIC3蛋白是弓形蟲微線體內(nèi)容物的一種，在弓形蟲入侵宿主過程中起到連接弓形蟲和宿主的橋梁的作用[9].MIC3是一種大小為90

5、KD蛋白，參與蟲體與宿主細胞間的黏附過程，且在弓形蟲速殖子、緩殖子和子孢子三個感染階段都有表達。MIC3在早期能夠誘導(dǎo)小鼠和人分泌高效價的IgG抗體以及IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10等細胞因子，使機體產(chǎn)生高強度的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，作為疫苗候選分子具有巨大的潛力。 本實驗根據(jù)已發(fā)表的弓形蟲SAG1及MIC3基因序列，在保證其開放讀碼框架正確的前提下，自行設(shè)計合成引物，在引物的5’末端分別加上適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切

6、位點，PCR擴增得到SAG1及MIC3基因。鑒定基因片段后通過克隆技術(shù)，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SAG1-MIC3、pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC3。并對氨芐篩選的重組入外源基因的質(zhì)粒通過PCR、酶切和測序鑒定。采用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)染Hela細胞，轉(zhuǎn)染后Trizol提取細胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一條鏈。管家基因β-actin PcR驗證逆轉(zhuǎn)錄，SAG1-MIC3、SA