敲除Tsc1基因對小鼠乳腺組織的影響研究.pdf

1、背景及目的：
　　Tsc1和Tsc2基因的名字來源于結節(jié)性硬化癥(Tuberous sclerosis complex，Tsc)，這是一種嚴重的常染色體顯性遺傳疾病，當Tsc1和Tsc2中的一個或兩個基因發(fā)生突變就會造成結節(jié)性硬化癥(TSC)。結節(jié)性硬化癥(TSC)的特點是多個器官和組織，包括真皮，平滑肌，腎和神經系統(tǒng)形成錯構瘤。正由于Tsc1和Tsc2基因突變會帶來嚴重的后果，這兩個基因的功能受到了廣泛的關注和研究。由Tsc1基

2、因編碼的hamartin蛋白質和由Tsc2基因編碼的tuberin蛋白質在細胞內共同形成功能性異二聚體（TSC1/TSC2復合物），該復合物具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性，在控制細胞大小，細胞周期和細胞增殖的信號通路中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用。TSC1和TSC2蛋白通過它們各自的卷曲螺旋結構域相互結合。TSC2蛋白質的C-末端含有GAP結構域，而TSC1蛋白則負責保護TSC2蛋白不受泛素介導的降解。研究表明，當在果蠅體內突變失活Tsc1或T

3、sc2中任一個基因，所引起的表型是相同的。因此，干擾或敲除Tsc1或Tsc2中的任何一個，都能有效抑制TSC1/TSC2復合物發(fā)揮生物學作用。
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，屬于磷脂激酶相關激酶家族，它是TSC1/TSC2復合物的重要下游靶分子。mTOR主要以兩種蛋白復合物的形式存在于細胞中并發(fā)揮激酶活性:mTOR復合物1(mTOR co

4、mplex1，mTORC1)和mTOR復合物2(mTORcomplex2，mTORC2)。mTORC1由mTOR以及4個調節(jié)蛋白:Raptor、PRAS40、mLST8和DEPTOR共同構成。其所介導的信號通路負責接收作用于細胞的營養(yǎng)、能量、應激等信號，調節(jié)蛋白質翻譯，進而調控細胞生長、增殖與自噬。小GTP酶Rheb(Ras-homology enriched in brain)是mTORC1的直接上游激活蛋白，而Rheb的活性由TSC

5、1/TSC2復合物控制。TSC1/TSC2復合物與GTP結合狀態(tài)的Rheb結合，并將GTP水解，轉為GDP結合狀態(tài)的Rheb喪失激酶活性，無法激活其下游的mTORC1。因此，TSC1/TSC2復合物實際上發(fā)揮著抑制mTORC1活性的作用。當營養(yǎng)、能量等信號刺激時，TSC1/TSC2復合物被磷酸化，導致它們與Rheb的結合被解除，Rheb的激酶活性恢復，進而激活mTORC1。當Tsc1或Tsc2基因缺失時，也就失去了TSC1/TSC2復合

6、物對Rheb活性的抑制，從而導致mTORC1持續(xù)性激活。S6K和4EBP-1是位于mTORC1下游的兩個重要效應蛋白，他們所調控的信號通路都與促進蛋白質合成有關，因而在細胞生長方面發(fā)揮重要調節(jié)作用。其中，S6K被mTORC1磷酸化激活后，可進一步磷酸化下游的核糖體蛋白S6，磷酸化的S6(p-S6)促進核糖體蛋白合成。因此，p-S6通常被視為mTORC1活化的指標。除了mTORC1，AKT也是調控細胞增殖與存活的重要蛋白。為了控制細胞的有

7、序生長與增殖，促進細胞生長的信號不能被無限放大。因此，在mTORC1和AKT之間存在著負反饋調節(jié)。mTORC1激活的S6K一方面磷酸化S6促進蛋白質翻譯，另一方面則通過磷酸化胰島素受體底物-1(IRS-1)而破壞IRS-1與胰島素受體或胰島素樣生長因子受體的結合，從而使胰島素或胰島素樣生長因子信號不能正常傳遞到AKT分子，進而抑制AKT活性。這條負反饋調節(jié)通路在控制細胞生長和增殖方面起到重要的作用。
　　組織和器官發(fā)育需要適當的細

8、胞生長，增殖和凋亡，由此可推斷mTORC1信號在組織器官發(fā)育中必定發(fā)揮著重要作用。然而，Tsc1或Tsc2基因全身敲除的胚胎致死性阻礙了人們對mTORC1信號在組織器官發(fā)育中的作用的研究。在一些重要組織器官——比如乳腺的發(fā)育中，mTORC1信號起著怎樣的作用尚未闡明。我們的研究采用Cre-LoxP系統(tǒng)建立乳腺管腔乳腺上皮細胞特異性敲除Tsc1的小鼠模型，這種小鼠能夠正常出生、成長、進入性成熟期，是研究mTORC1信號與乳腺發(fā)育的理想模型

9、。有趣的是，我們的研究發(fā)現敲除小鼠乳腺上皮細胞Tsc1基因后，并沒有如預期般造成乳腺上皮細胞過度增生，反而明顯抑制了小鼠乳腺導管的發(fā)育。進一步的研究證明，適度的mTORC1活性對于青春期小鼠乳腺發(fā)育的極為重要。
　　方法：
　　利用LoxP-flanked Tsc1(Tsc1 L/L)小鼠及MMTVCre+小鼠雜交構建乳腺上皮細胞特異性敲除Tsc1的模型小鼠(Tsc1L/LMMTVCre+);通過Tsc1L/wt小鼠與MMT

10、VCre+小鼠雜交獲得Tsc1未被敲除的Tsc1wt/wtMMTVCre+小鼠作為正常對照。
　　小鼠于出生后4-6周處死，取第4對乳腺脂肪墊通過全乳腺包埋染色(Wholemount staining)觀察乳腺發(fā)育情況，在高倍鏡下計數乳腺二級導管數量及終末腺泡(TEB)數量。利用BrdU法檢測乳腺上皮細胞增殖，利用TUNEL法檢測乳腺上皮細胞凋亡。通過免疫組織化學法檢測乳腺上皮TSC1、p-S6、p-PDK1、p-AKT(ser3

11、08)、p-AKT(ser473)、IRS-1、ERα、cyclin D1、cyclin E、CDK4、CDK2、p-Rb及p27kip1的表達。
　　雷帕霉素逆轉實驗:4周大的小鼠給予腹腔注射雷帕霉素0.1 mg/kg，每2天1次，連續(xù)2周;取相同基因型相同周齡的小鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。2周后處死小鼠，進行上述實驗。
　　結果：
　　1.成功建立了乳腺上皮特異性敲除Tsc1基因的小鼠模型;
　　2.Tsc

12、1基因敲除抑制小鼠乳腺導管發(fā)育，使小鼠乳腺上皮細胞增殖降低而凋亡增加;
　　3.Tsc1基因敲除乳腺上皮細胞的p-S6表達上調，mTORC1抑制劑雷帕霉素可逆轉該小鼠乳腺p-S6的上調并一定程度上恢復乳腺導管發(fā)育，說明mTORC1活性增高導致該小鼠乳腺發(fā)育障礙;同時，相同劑量的雷帕霉素作用于正常基因型小鼠也引起乳腺導管發(fā)育障礙，提示適當的mTORC1活性對乳腺正常發(fā)育至關重要;
　　4.Tsc1基因敲除乳腺上皮細胞的AKT蛋

13、白活性下調，該下調可被雷帕霉素逆轉，提示mTORC1持續(xù)激活對AKT的負反饋抑制可能是導致乳腺上皮細胞增殖抑制、凋亡增加的機制之一;
　　5.Tsc1基因敲除抑制乳腺上皮細胞的ERα及IRS-1的核內表達下調，該下調可被雷帕霉素逆轉，提示ERα的核內信號通路被抑制可能是Tsc1基因敲除導致乳腺發(fā)育障礙的機制之一;
　　6.Tsc1基因敲除乳腺上皮的細胞周期相關蛋白Cyclin D1，Cyclin E，CDK2及CDK4的表達

14、下調，該下調可被雷帕霉素逆轉，提示Tsc1基因敲除可能通過下調細胞周期蛋白表達抑制乳腺上皮細胞增殖，從而導致乳腺導管發(fā)育障礙。
　　結論：
　　綜上所述，本課題研究敲除Tsc1基因在小鼠乳腺導管發(fā)育中的作用，發(fā)現適當的mTORC1活性對小鼠青春期乳腺導管的發(fā)育至關重要。mTORC1持續(xù)激活或者活性不足都會導致青春期小鼠乳腺導管發(fā)育障礙。Tsc1基因敲除導致乳腺發(fā)育受阻的分子機制可能包括:1，mTORC1的持續(xù)性激活負反饋抑制