條件性敲除小鼠卵母細胞ggps1基因及其對繁殖性狀的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、基因打靶技術是定向改變或修飾生物活體遺傳信息的實驗手段?;虼虬行揎椇筮z傳信息能夠在生物體內遺傳并表現這些突變的性狀,這為研究特定基因的功能、疾病的診斷治療和藥物篩選評價等提供了可能?;虼虬屑夹g使研究者可以在生物體整體水平、組織水平、細胞水平、分子水平各個層次上系統的研究基因功能。同源重組是指發(fā)生在減數分裂或者有絲分裂過程中相同或相似DNA序列之間的重組。它通常通過一對同源非姊妹染色單體之間的斷裂而產生新的重組片段。胚胎干細胞是具有無

2、限分裂能力的細胞,它能通過不對稱分裂在復制自己的同時產生不同類型的細胞。胚胎干細胞技術和同源重組技術的發(fā)展使基因打靶技術常規(guī)化。
   GGPS1蛋白是異戊二烯基轉移酶家族中的一員,具有GGPP合酶活性,能夠催化法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP)和異戊烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate,IPP)縮合成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophospha

3、te,GGPP)的反應。FPP不僅是合成膽固醇的中間產物,還是類異戊二烯化合物(isoprenoid)如牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(GGPP)、多萜醇(dolichol)和泛醌(CoQ)合成的前體。FPP和GGPP還是蛋白質異戊二烯化修飾的底物。通過添加疏水的異戊二烯基團,蛋白質能夠錨定在細胞膜上參與對細胞生長、分化、細胞骨架形成和囊泡輸等調控。
   Cre重組酶能夠介導兩個loxp位點之間的特異性重組。Cre-loxp系統由于它的

4、穩(wěn)定高效被廣泛應用于建立基因敲除小鼠模型。采用正負雙篩選策略,通過在ggps1基因外顯子3和外顯子4的兩端插入loxp位點和neo正向篩選基因,在靶基因3'同源臂的外端,插入胸苷激酶基因TK作為負篩選基因,經過打靶載體的構建及驗證、轉染胚胎干細胞、囊胚腔注射、胚胎移植代孕母鼠過程,得到了對ggps1基因遺傳修飾過的小鼠。ggps1基因遺傳修飾過的小鼠再與卵母細胞特異性表達Cre酶的小鼠(ZP3-Cre)交配,產生的后代就有卵母細胞特異性

5、敲除ggps1基因的小鼠。
   ZP3是卵母細胞特異性表達的透明帶蛋白3,在卵泡被激活發(fā)育后開始表達。卵母細胞ZP3表達后,ZP3啟動子調控下的Cre酶也將會表達,Cre酶會識別兩個序列相同的Loxp位點之間的序列并將其刪除。卵母細胞中的ggps1基因就是在此時被敲除的。此時的小鼠大約在出生后一周。經過長期配對實驗發(fā)現,雜合子小鼠與野生型小鼠繁殖性狀無差異;純合子ZP3-Cre/ggps1-/-與雜合子ZP3-Cre/ggps

6、1+/-或野生型小鼠相比,平均窩產仔數和產仔窩數均顯著減少。為了找到純合子ZP3-Cre/ggps1-/-與雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-繁殖性狀差異的原因,分析比較了出生后10天、14天、22天、28-30天、35-38天的卵巢切片。結果顯示純合子ZP3-Cre/ggps1-/-與雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-卵巢發(fā)育在出生后兩周就有差異。主要表現在出生后兩周次級卵泡(4型)過早形成卵泡腔,同時伴隨卵巢血管發(fā)育變快,卵

7、泡顆粒細胞肥大、不對稱生長及多卵卵泡現象。至四周齡時純合子ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠卵巢外觀明顯小于雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-,卵巢重量比較兩組差異顯著。卵巢連續(xù)切片顯示純合子ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠大量次級卵泡中的卵母細胞皺縮退化、并有卵泡膜細胞肥大增生和黃體化樣變化,盡管腹腔注射PMSG后卵巢中次級卵泡形態(tài)似乎正常,但是大量有腔卵泡和排卵前卵泡形成類似黃體樣結構。經過PMSG和HCG處理后,純合子Z

8、P3-Cre/ggps1-/-小鼠排卵數顯著少于雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-,并且純合子ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠排除的卵母細胞形態(tài)異常,GV期卵母細胞顯著少于對照組,卵母細胞體外受精率和受精后早期胚胎發(fā)育能力也顯著低于對照組。在對性成熟后的8-10周小鼠卵巢切片研究發(fā)現,每個發(fā)情周期中卵泡發(fā)育也同四周齡小鼠一致,大量次級卵泡發(fā)育停滯在早期有腔卵泡階段,卵泡類黃體樣變化。
   TGFβ家族成員中GDF9和B

9、MP15是卵泡發(fā)育過程中的主要調控因子。TGFβ家族成員發(fā)揮作用需要smad家族成員的介導激活。Smad4即為通用型TGFβ介導調節(jié)因子。ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠的繁殖缺陷和卵泡發(fā)育缺陷與GDF9-/-和BMP15-/-GDF9+/-及AMHcresmad4-/-小鼠表型高度一致。推測ggps1的敲除可能影響了TGFβ家族成員的功能。通過序列比對發(fā)現,TGFβ家族成員羧基端氨基酸序列符合異戊二烯化修飾的“CaaX”序列特征,

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