神經元特異性NSSR1基因敲除對小鼠腦組織發(fā)育的影響.pdf

1、神經細胞特異性絲氨酸/精氨酸富集蛋白(neural salient serine/argininerich protein-1，NSSR1)是迄今發(fā)現的為數極少的幾種在神經組織高表達的SR蛋白之一，主要參與調控前體mRNA剪接，從而調節(jié)基因表達。已有的研究表明，NSSR1基因的轉錄產物在人和小鼠各組織中廣泛表達，而其蛋白主要在腦組織中表達，具有神經組織特異性。在培養(yǎng)的細胞和低等生物體內的研究顯示，NSSR1具有促進神經元分化的作用。提示

2、NSSR1蛋白在腦組織的生長發(fā)育中可能具有重要功能，然而迄今為止，關于NSSR1在高等生物體內(in vivo)功能的研究還很少。鑒于此，本論文的總目標是，通過構建神經元特異性敲除NSSR1基因的小鼠，初步研究NSSR1基因敲除對小鼠腦發(fā)育的影響，從而為研究NSSR1蛋白的在體生理功能奠定基礎。
　　我們首先利用免疫組織化學的方法觀察野生型(WT)小鼠腦內NSSR1蛋白的分布特征，發(fā)現NSSR1蛋白在嗅球(Olfactory Bu

3、lb)、皮層(Cerebral Cortex)、海馬(Hippocampus)、上丘(Superior Colliculus)、下丘(Inferior Colliculus)以及小腦(Cerebellum)中大量表達，在其他腦區(qū)較少表達或幾乎沒有表達。通過NSSR1抗體和NeuN抗體/GFAP抗體免疫共定位，我們觀察到NSSR1蛋白主要在神經元中表達，并且主要在核內分布。這些結果說明，NSSR1的分布具有組織特異性以及細胞類型特異性的特

4、點。
　　已有研究顯示，全身性敲除NSSR1基因會導致小鼠的胚胎死亡，提示構建條件性敲除NSSR1基因的小鼠對研究其在體功能的必要性。鑒于NSSR1蛋白選擇性地在神經元中表達的特點，我們選擇利用Cre/loxP系統(tǒng)構建神經元特異性敲除NSSR1基因的小鼠。我們主要通過敲除NSSR1基因的exon3而造成該基因的移碼突變，使蛋白翻譯提前終止，產生無功能的截短型NSSR1蛋白。我們首先構建了exon3兩端各有一個loxP位點的Flox

5、小鼠，并將其與Nse-Cre小鼠雜交，篩選獲得雙轉基因的Cre+Flox+/+小鼠。通過基因和蛋白水平的鑒定，證明這種Cre+ Flox+/+小鼠腦組織基因組中exon3被切除，而同時NSSR1蛋白的表達量也明顯降低。所以Cre+Flox+/+小鼠即為神經元特異性敲除NSSR1基因的小鼠（NSSR1 cKO小鼠），將這一小鼠作為體內研究NSSR1蛋白功能的主要模型。
　　在成功構建了NSSR1基因條件敲除小鼠（cKO小鼠）的基礎上

6、，我們進一步利用該小鼠模型，從小鼠表型、腦的形態(tài)結構、以及小鼠行為學指標等方面對NSSR1蛋白在小鼠腦發(fā)育中的功能進行研究。
　　首先我們對不同發(fā)育時期cKO小鼠和正常小鼠的體重、腦的形態(tài)和重量進行了比較，結果顯示，在出生后1d，7d，14d，21d，1month，2month時，兩種小鼠的體重沒有顯著性差異，不同發(fā)育時期兩種小鼠腦的形態(tài)和重量也沒有明顯的差異。即:NSSR1基因的神經元特異性敲除沒有引起小鼠個體表征上的顯著改變。

7、
　　進一步，我們利用結晶紫(CV)、以及成熟神經元的標志物NeuN和星形膠質細胞的標志物GFAP染色小鼠腦片的方法，對cKO小鼠腦的形態(tài)結構進行了分析，結果顯示，和野生型小鼠相比，cKO小鼠腦內的神經細胞CV染色變淺，大腦皮層明顯變厚，皮層的神經細胞個體變小，細胞間排布更松散。NeuN和GFAP免疫染色的結果顯示，在cKO小鼠中NeuN的染色變淺，而GFAP染色的星形膠質細胞數量顯著增多，且細胞胞體增大，突起增多。該研究結果顯示

8、，NSSR1條件敲除引起了腦內神經元和星形膠質細胞的排布、數量和胞體特征的改變，這可能是通過影響腦內細胞的增殖、凋亡、分化或成熟來實現的。
　　為進一步探索NSSR1基因敲除是否影響小鼠腦內細胞增殖、凋亡、分化或成熟，我們針對不同發(fā)育階段的神經元標記物DCX和MAP2對小鼠腦片進行免疫組織（熒光）化學分析，結果顯示，和同窩對照小鼠相比，cKO小鼠視皮層DCX標記的幼稚神經元數目增多，整個皮層MAP-2標記的神經元樹突密度減少、長度

9、變短。而在海馬區(qū)，DCX標記的熒光信號減弱，且細胞突起的長度變短，而MAP2標記的成熟神經元的突起反而增加。
　　鑒于海馬是小鼠學習記憶的主要腦區(qū)，我們進一步用水迷宮和新物體識別實驗研究了NSSR1基因敲除對小鼠學習記憶功能的影響，結果顯示，和同窩對照小鼠相比，NSSR1 cKO小鼠的學習記憶能力和對新物體的識別能力都有顯著降低。
　　綜上所述，本論文在成功構建NSSR1基因神經元特異性敲除小鼠的基礎上，從小鼠腦的形態(tài)結構和