茶多酚對銅藍蛋白基因敲除小鼠糖代謝的影響及機制.pdf

1、目的：
　　糖尿病是一組以血漿葡萄糖水平增高為特征的慢性代謝性疾病，其病理特點是胰島β細(xì)胞功能受損和/或胰島素抵抗。近年來，越來越多的研究表明，鐵過載可增加糖尿病的患病風(fēng)險，體內(nèi)鐵過載是2型糖尿病的獨立危險因素。鐵是人體內(nèi)含量最多的必需微量元素，鐵穩(wěn)態(tài)對于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。銅藍蛋白(ceruloplasmin, Cp)是鐵轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵酶，主要在肝細(xì)胞合成，具有亞鐵氧化酶活性，可將Fe2+氧化成Fe3+，促進鐵

2、與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合。Cp基因敲除(Cp-/-)后可以導(dǎo)致組織鐵過載，以及糖耐量異常，但其具體機制不詳。茶多酚是一種天然的抗氧化劑，具有螯合鐵的特性，目前茶多酚對 Cp-/-小鼠糖代謝的影響機制尚未見詳細(xì)報道。本課題組以Cp基因敲除（內(nèi)源性鐵過載）小鼠為研究對象，探討鐵過載導(dǎo)致糖代謝異常的具體作用機制；同時，應(yīng)用茶多酚灌胃進行干預(yù)治療，明確茶多酚對Cp基因敲除小鼠糖代謝的影響，以期為糖尿病患者提供新的治療選擇。
　　方法：
　　隨

3、機選取12只10月齡雌性BALB/cJ×129SvJ品系銅藍蛋白基因敲除（Cp-/-）小鼠作為實驗組，另選取12只同性別、同月齡、同品系的野生型（Cp+/+）小鼠作為對照組，將實驗組和對照組小鼠分別隨機分為茶多酚干預(yù)組（TPG, n=6）和生理鹽水處理組（NSG, n=6）進行干預(yù)，4周后，通過葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗評估小鼠胰島β細(xì)胞的儲備功能和胰島素敏感性。放射免疫法檢測小鼠血清胰島素水平；比色法檢測肝臟非血紅素鐵含量；免疫組

4、化法檢測胰腺鐵沉積情況；黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性、硫代巴比妥酸法測定丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量以明確肝臟氧化應(yīng)激水平；原位末端標(biāo)記（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）法檢測肝實質(zhì)細(xì)胞和胰島β細(xì)胞的凋亡情況；Real-t

5、ime PCR測定肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運體2（glucose transporter, GLUT2）、胰島素受體底物2（insulin receptor substrate2, IRS2） mRNA表達水平；Western-blot法測定肝臟GLUT2、IRS2的蛋白表達水平。應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料均進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（-X±SD）表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以（最小值，最大值）表示。正態(tài)分布且

6、方差齊性數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD檢驗。不符合正態(tài)分布的資料采用獨立樣本的Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1與Cp+/+ NSG小鼠相比，Cp-/-NSG小鼠血糖顯著升高（葡萄糖耐量實驗各點血糖值：0 min6.80±0.91 mmol/L比4.98±0.71 mmol/L, P0min=0.004；15 min14.88±0.69 mmol/L比

7、12.70±0.67 mmol/L, P15min=0.011；30 min15.45±0.97 mmol/L比8.85±0.79 mmo l/L, P30min＜0.001；60 min10.30±1.61 mmo l/L比7.75±0.37 mmol/L, P60min=0.004；120 min8.00±0.70 mmol/L比5.68±0.34 mmol/L, P120min＜0.001），胰島素敏感性顯著下降（胰島素耐量實驗各

8、點血糖值：0 min7.15±1.20 mmol/L比5.13±0.54 mmol/L, P0min=0.001；15 min5.58±0.87 mmo l/L比4.18±0.49 mmol/L, P15min=0.014；30 min3.55±0.60 mmol/L比2.80±0.28 mmo l/L, P30min=0.013；60 min2.30±0.22 mmol/L比1.63±0.25 mmol/L, P60min＜0.001

9、）。Cp+/+TPG與Cp+/+NSG組間血糖無顯著差異（葡萄糖耐量實驗各點血糖值：0 min4.35±0.68 mmol/L比4.98±0.71 mmol/L, P0min=0.245；15 min12.70±1.44 mmol/L比12.70±0.67 mmol/L, P15min=1.000；30 min8.23±0.75 mmol/L比8.85±0.79 mmol/L, P30min=0.450；60 min7.68±0.54

10、mmo l/L比7.75±0.37 mmol/L, P60min=0.919；120 min4.90±0.78 mmo l/L比5.68±0.34 mmol/L, P120min=0.091），胰島素敏感性也無明顯變化（胰島素耐量實驗各點血糖值：0 min4.95±0.24 mmo l/L比5.13±0.54 mmol/L, P0min=0.726；15 min4.03±0.73 mmol/L比4.18±0.49 mmol/L, P15

11、min=0.763；30 min2.33±0.26 mmo l/L比2.80±0.28 mmol/L, P30min=0.089；60 min1.43±0.10 mmol/L比1.63±0.25 mmol/L, P60min=0.167）。與Cp-/-NSG小鼠相比，Cp-/-TPG小鼠血糖明顯降低（葡萄糖耐量實驗各點血糖值：0 min5.65±0.53 mmol/L比6.80±0.91 mmo l/L, P0min=0.044；15

12、min13.23±1.08 mmol/L比14.88±0.69 mmol/L, P15min=0.042；30 min12.70±1.74 mmol/L比15.45±0.97 mmo l/L, P30min=0.005；60 min7.23±1.08 mmo l/L比10.30±1.61 mmol/L,P60min=0.001；120 min5.45±0.47 mmo l/L比8.00±0.70 mmo l/L, P120min＜0.0

13、01），胰島素敏感性顯著升高（胰島素耐量實驗各點血糖值：0 min5.10±0.35 mmol/L比7.15±1.20 mmol/L, P0min=0.001；15 min4.13±0.61 mmo l/L比5.58±0.87 mmol/L, P15min=0.011；30 min2.53±0.15 mmol/L比3.55±0.60 mmol/L, P30min=0.002；60 min1.48±0.17 mmo l/L比2.30±0.

14、22 mmol/L, P60min＜0.001）。
　　2血清胰島素水平：與Cp+/+ NSG相比，Cp-/-NSG小鼠血清空腹胰島素水平明顯升高，但第一時相胰島素分泌無統(tǒng)計學(xué)差異(0min37.93±3.36 uIU/ml比33.91±2.38uIU/ml, P0min=0.036;79.31±7.84 uIU/ml比68.81±6.89 uIU/ml, P30min=0.068)；Cp+/+TPG和Cp+/+NSG組間空腹血清

15、胰島素及第一時相胰島素水平均無明顯差異(31.58±2.09 uIU/ml比33.91±2.38 uIU/ml, P0min=0.198;69.11±8.38 uIU/ml比68.81±6.89 uIU/ml, P30min=0.956)；茶多酚干預(yù)4周后，與C p-/-NSG組相比，C p-/-T PG組小鼠血清空腹胰島素水平降低，但第一時相胰島素分泌無統(tǒng)計學(xué)差異(33.88±1.44 uIU/ml比37.93±3.36 uIU/ml

16、, P0min=0.035;71.35±6.37 uIU/ml比79.31±7.84 uIU/ml, P30min=0.154)。
　　3肝臟組織鐵含量：與Cp+/+NSG相比, Cp-/-NS G小鼠肝臟發(fā)生了嚴(yán)重鐵沉積（21.47±3.53mg/gprot比3.04±0.61mg/gprot, P＜0.001），經(jīng)茶多酚干預(yù)4周后，與Cp-/-NSG相比，Cp-/-TPG小鼠肝臟鐵沉積得到了明顯改善(10.77±1.13 mg

17、/gprot比21.47±3.53mg/gprot, P＜0.001)。但Cp+/+TPG與 Cp+/+ NSG組間未見顯著差異(2.68±0.55 mg/gprot比3.04±0.61mg/gprot, P=0.827)。
　　4胰島素免疫組化與鐵沉積普魯士藍染色結(jié)果顯示，鐵沉積主要發(fā)生在胰腺外分泌部的胰腺腺泡細(xì)胞，而非胰島β細(xì)胞。胰腺凋亡也主要發(fā)生在胰腺外分泌部的胰腺腺泡細(xì)胞，而非胰島β細(xì)胞。
　　5氧化應(yīng)激：與生理鹽水

18、處理的野生組小鼠相比, Cp-/- NSG小鼠SOD水平顯著降低（1.70±0.27 U/mgprot比2.11±0.09 U/mgprot， P=0.005）、MDA水平明顯升高（5.46±0.51 nmol/mgprot比4.41±0.43 nmol/mgprot，P=0.001）；經(jīng)茶多酚干預(yù)4周后，Cp-/-TPG小鼠SOD水平顯著升高（2.46±0.21U/mgprot比1.70±0.27U/mgprot，P＜0.001）、M

19、DA水平明顯降低（4.75±0.48 nmol/mgprot比5.46±0.51 nmol/mgprot，P=0.019）。此外，與生理鹽水處理的野生組小鼠相比，茶多酚干預(yù)的野生組小鼠 SOD水平明顯升高（2.53±0.14 U/mgprot比2.11±0.09 U/mgprot，P=0.004）、MDA水平顯著降低（3.76±0.25 nmol/mgprot比4.41±0.43 nmol/mgprot，P=0.031）。
　　6

20、 Cp-/-NSG小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于Cp+/+NSG小鼠（67.00±4.58比13.67±2.08，P＜0.001），經(jīng)茶多酚灌胃干預(yù)后，Cp-/-TPG小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)較Cp-/-NSG明顯降低（38.33±5.03比67.00±4.58，P＜0.001）。Cp+/+ TPG與Cp+/+NSG兩組間肝細(xì)胞凋亡數(shù)目無顯著差異（12.67±2.52比13.67±2.08，P=0.754）。
　　7與Cp+/+NSG相比, C

21、p-/-NSG小鼠肝臟IRS2 mRNA和蛋白表達水平[(0.09,0.29)比(0.42,0.78)，PmRNA=0.011；（0.52±0.05比0.70±0.07）， Pprotein=0.024]，以及肝臟GLUT2 mRNA和蛋白表達水平顯著降低[（0.03±0.02比0.97±0.13），PmRNA＜0.001；（0.45±0.05比0.81±0.06），Pprotein＜0.001]；經(jīng)茶多酚為期4周的干預(yù)后，與Cp-/-

22、NS G組相比，C p-/-T PG組小鼠肝臟 IRS2 mRNA和蛋白表達水平[(0.46,0.88)比(0.09,0.29)， PmRNA=0.006；（0.69±0.05比0.52±0.05），Pprotein=0.029]，以及肝臟GLUT2 mRNA和蛋白表達水平[（0.96±0.23比0.03±0.02），PmRNA＜0.001；（0.75±0.06比0.45±0.05），Pprotein＜0.001]顯著升高。Cp+/+N

23、SG組和Cp+/+TPG組小鼠肝臟 IRS2 mRNA和蛋白表達水平[(0.74,1.48)比(0.42,0.78)， PmRNA=0.077；（0.72±0.12比0.70±0.07），Pprotein=0.759]，以及肝臟GLUT2 mRNA和蛋白表達水平[（1.02±0.22比0.97±0.13），PmRNA=0.755；（0.84±0.04比0.81±0.06），Pprotein=0.478]無顯著變化。
　　結(jié)論：