溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　目的:針對課題組在國內(nèi)首次制備具有溫敏特性的殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖(HBC)水凝膠，通過該材料在體外對成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長影響的研究，探討該材料的細(xì)胞學(xué)行為，為材料的最終臨床應(yīng)用提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:1.HBC浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的影響于37℃下將HBC水凝膠浸提于DMEM培養(yǎng)液24小時(shí)得浸

2、提液。設(shè)置陰性對照組、苯酚陽性對照組及25％、50％、75％、100％濃度浸提液四個(gè)實(shí)驗(yàn)組，設(shè)3塊96孔培養(yǎng)板，10孔平行對照組，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察L929細(xì)胞生長情況，通過MTS法測定吸光度OD值，計(jì)算出不同組細(xì)胞的存活率。將L929細(xì)胞分別用陰性對照液、50％HBC浸提液及100％HBC浸提液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后用流式細(xì)胞學(xué)的方法檢測L929細(xì)胞凋亡情況。
　　2.HBC浸提液對

3、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人肺成纖維細(xì)胞(HLF)的影響設(shè)25％、50％、75％、100％HBC浸提液4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人肺成纖維細(xì)胞(HLF)在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入100μl待測液，設(shè)3塊96孔培養(yǎng)板，10孔平行對照組，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞的生長情況，通過MTS法測定HUVEC細(xì)胞的吸光度OD值，計(jì)算出不同濃

4、度組HUVEC細(xì)胞的存活率。
　　結(jié)果:在HBC浸提液L929細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，25％、50％和75％、100％濃度的浸提培養(yǎng)液組及陰性對照組細(xì)胞死亡情況較苯酚陽性對照組有顯著差異(P＜0.001)，HBC浸提液可明顯抑制L929細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡。流式細(xì)胞學(xué)檢測:HBC浸提液可以將L929細(xì)胞部分阻礙在G1期向S期分化過程中(P＜0.05)，驗(yàn)證了其凋亡存在性。HBC浸提液對HUVEC無細(xì)胞毒性，且100％浸提液對于HUVEC

5、細(xì)胞較陰性對照組有輕度促進(jìn)生長作用(P＜0.001)。通過觀察發(fā)現(xiàn)第4天HLF細(xì)胞也出現(xiàn)了與L929細(xì)胞相似的凋亡細(xì)胞學(xué)形態(tài)。
　　結(jié)論:溫敏性羥丁基殼聚糖（HBC）未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，但對成纖維細(xì)胞有一定的抑制作用。
　　第二部分 溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　目的:本研究使用羥丁基殼聚糖(HBC)，研制出一種新型可原位注射、溫敏性凝膠系統(tǒng)。通過動(dòng)物體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)、致熱原

6、實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、免疫毒性實(shí)驗(yàn)等，初步評(píng)價(jià)該材料的生物安全性，為材料的最終臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:1.急性毒性實(shí)驗(yàn)將HBC水凝膠在生理鹽水下浸提24小時(shí)后，濾去沉淀，得到HBC生理鹽水浸提液。將清潔級(jí)健康SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，每組各5只，通過尾緣靜脈以0.1mL/s的速度、50mL/kg的劑量注射入實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)，觀察大鼠死亡情況。
　　2.致熱原實(shí)驗(yàn)通過耳緣靜脈將上述HBC生理鹽水浸提液以0.1m

7、L/s的速度、2.5mL/kg的劑量注射入7只清潔級(jí)新西蘭兔體內(nèi)后，觀察體溫變化情況。
　　3.皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)將4種不同的待測液（100％HBC浸提液、50％ HBC浸提液、生理鹽水、苯酚溶液）通過皮內(nèi)注射入5只清潔級(jí)新西蘭兔的背部，觀察其皮膚改變情況。
　　4.免疫毒性實(shí)驗(yàn)將80只大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組和對照組，腹腔給藥2周，每周2次，恢復(fù)周期14天，檢測大鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)后進(jìn)行比較。取大鼠股骨骨髓組織，用吉姆薩染液染

8、色后觀察骨髓涂片。
　　結(jié)果:HBC浸提液注入SD大鼠體內(nèi)一周后未引起大鼠死亡及不適，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。將HBC浸提液注射入新西蘭兔體內(nèi)未引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫升高，致熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。將HBC浸提液注射入新西蘭兔背部皮膚，實(shí)驗(yàn)組皮膚刺激反應(yīng)與陰性生理鹽水組相似，無明顯皮膚顏色改變，而與陽性對照組有顯著性差異。血清免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白IgA、IgG、補(bǔ)體C3、殺傷型(CD3+CD8+)T細(xì)胞等檢測指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值＜0