間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)神經(jīng)向誘導(dǎo)實驗條件優(yōu)化及胞內(nèi)鈣離子濃度動態(tài)變化.pdf

1、目的：分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)比較二者生物學(xué)特性及體外增殖能力，并探討三種不同成神經(jīng)誘導(dǎo)方法對AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中的影響，提高AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)效率，從而為研究AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。深入探

2、討成球誘導(dǎo)方法中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，有助于闡明AMSCs的成神經(jīng)誘導(dǎo)分化機(jī)理，為AMSCs在臨床再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：(1)采用密度梯度離心法分離BMSCs及酶消化法體外分離AMSCs。檢測MSCs的表面抗原以及將MSCs進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)，成脂誘導(dǎo)對MSCs的干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。(2)三種誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，包括化學(xué)誘導(dǎo)方法、鼠腦條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)方法、成神經(jīng)球分化誘導(dǎo)方法。觀察誘導(dǎo)中的形

3、態(tài)變化，免疫熒光檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物β-Ⅲ-Tubulin，NSE和Nissl的表達(dá)。確定最高效的誘導(dǎo)方法。(3)采取成神經(jīng)球誘導(dǎo)方法對AMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，利用Fluo3/AM對AMSCs及誘導(dǎo)過程中的類神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀對AMSCs群體細(xì)胞的鈣離子濃度檢測，并通過共聚焦顯微鏡確定單個細(xì)胞中鈣離子濃度的變化，研究細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度在AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中的變化。
　　 結(jié)果：(1)獲得的BMSCs及

4、AMSCs可穩(wěn)定傳至20代以上。表型鑒定結(jié)果為CD13、CD90陽性，CD34、CD45陰性，AMSCs的CD106陰性，BMSCsCD106表達(dá)弱陽性。成骨細(xì)胞分化28d時，Von kossa陽性，向脂肪細(xì)胞分化14d時，油紅O染色陽性。(2)用化學(xué)因子誘導(dǎo)AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，30d時出現(xiàn)成熟神經(jīng)元標(biāo)記NSE的表達(dá)，陽性值為29.5％，但細(xì)胞凋亡明顯。鼠腦條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)14d時，NSE略有表達(dá)，值為12.8％。采用成神經(jīng)球誘導(dǎo)

5、方法進(jìn)行7d成神經(jīng)球誘導(dǎo)，再經(jīng)過7-9天的分化培養(yǎng)。在7d時有8.9％NSE表達(dá)。β-Ⅲ-Tubulin及Nissl在經(jīng)三種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)成熟后，均為陽性表達(dá)。(3)成球法誘導(dǎo)AMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中，取AMSCs及誘導(dǎo)不同時間點的成神經(jīng)細(xì)胞從細(xì)胞整體及個體角度分別證實：在成球誘導(dǎo)法誘導(dǎo)下，通過7天成神經(jīng)球后，在繼續(xù)的分化過程1-6天時細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度先呈上升趨勢，在分化7-9天時達(dá)到高峰，隨后急劇下落，與細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞發(fā)生凋亡的