間充質(zhì)干細胞(MSCs)神經(jīng)向誘導實驗條件優(yōu)化及胞內(nèi)鈣離子濃度動態(tài)變化.pdf

1、目的：分離提取骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)及脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)比較二者生物學特性及體外增殖能力，并探討三種不同成神經(jīng)誘導方法對AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中的影響，提高AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化誘導效率，從而為研究AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化機制奠定基礎。深入探

2、討成球誘導方法中細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，有助于闡明AMSCs的成神經(jīng)誘導分化機理，為AMSCs在臨床再生醫(yī)學上的應用提供理論依據(jù)。
　　 方法：(1)采用密度梯度離心法分離BMSCs及酶消化法體外分離AMSCs。檢測MSCs的表面抗原以及將MSCs進行體外成骨誘導，成脂誘導對MSCs的干細胞特性進行鑒定。(2)三種誘導方案誘導AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，包括化學誘導方法、鼠腦條件培養(yǎng)基誘導方法、成神經(jīng)球分化誘導方法。觀察誘導中的形

3、態(tài)變化，免疫熒光檢測神經(jīng)細胞特異性標志物β-Ⅲ-Tubulin，NSE和Nissl的表達。確定最高效的誘導方法。(3)采取成神經(jīng)球誘導方法對AMSCs進行誘導，利用Fluo3/AM對AMSCs及誘導過程中的類神經(jīng)細胞進行染色，通過流式細胞儀對AMSCs群體細胞的鈣離子濃度檢測，并通過共聚焦顯微鏡確定單個細胞中鈣離子濃度的變化，研究細胞內(nèi)游離鈣離子濃度在AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中的變化。
　　 結(jié)果：(1)獲得的BMSCs及

4、AMSCs可穩(wěn)定傳至20代以上。表型鑒定結(jié)果為CD13、CD90陽性，CD34、CD45陰性，AMSCs的CD106陰性，BMSCsCD106表達弱陽性。成骨細胞分化28d時，Von kossa陽性，向脂肪細胞分化14d時，油紅O染色陽性。(2)用化學因子誘導AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，30d時出現(xiàn)成熟神經(jīng)元標記NSE的表達，陽性值為29.5％，但細胞凋亡明顯。鼠腦條件培養(yǎng)基誘導14d時，NSE略有表達，值為12.8％。采用成神經(jīng)球誘導

5、方法進行7d成神經(jīng)球誘導，再經(jīng)過7-9天的分化培養(yǎng)。在7d時有8.9％NSE表達。β-Ⅲ-Tubulin及Nissl在經(jīng)三種誘導方法誘導成熟后，均為陽性表達。(3)成球法誘導AMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中，取AMSCs及誘導不同時間點的成神經(jīng)細胞從細胞整體及個體角度分別證實：在成球誘導法誘導下，通過7天成神經(jīng)球后，在繼續(xù)的分化過程1-6天時細胞內(nèi)鈣離子濃度先呈上升趨勢，在分化7-9天時達到高峰，隨后急劇下落，與細胞培養(yǎng)時細胞發(fā)生凋亡的