鯉魚卵鈣離子結(jié)合活性肽制備及其鈣結(jié)合機(jī)制的研究.pdf

1、本論文以鯉魚魚卵為研究對(duì)象,優(yōu)化酶解工藝制備魚卵鈣離子結(jié)合活性肽(FEP),優(yōu)化活性肽與鈣離子結(jié)合條件,制備魚卵肽鈣復(fù)合物(FEP-Ca),通過(guò)構(gòu)建缺鈣大鼠模型研究FEP-Ca促鈣吸收活性。從FEP中分離純化高活性鈣離子結(jié)合肽并鑒定其結(jié)構(gòu),對(duì)活性肽與鈣結(jié)合的機(jī)制進(jìn)行探討。研究結(jié)果如下:
　　1.鯉魚卵酶解制備FEP條件優(yōu)化
　　鯉魚卵脫脂后含有1.09％的磷,氮磷摩爾比為31.31,蛋白質(zhì)中絲氨酸摩爾百分?jǐn)?shù)為6.81%。以水

2、解度和酶解液鈣離子結(jié)合活性為指標(biāo),優(yōu)化了魚卵酶解工藝。結(jié)果表明胰蛋白酶對(duì)魚卵的酶解效果最好,當(dāng)魚卵脫磷率為30.39%時(shí),在49℃,加酶量3000 U/g,底物濃度2%,pH9.0條件下,水解度為31.15%,酶解液結(jié)合鈣活性最好,500 mg/ml酶解液能結(jié)合0.67 mmol/g的鈣。
　　2. FEP-Ca復(fù)合物制備條件優(yōu)化及其穩(wěn)定性
　　以 FEP的單位蛋白鈣結(jié)合量和鈣結(jié)合率為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)肽鈣結(jié)合反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)

3、果表明在FEP濃度為5 g/L,鈣離子濃度為5 mM,pH8.0,45℃,1 h條件下,FEP單位蛋白鈣結(jié)合量為0.86 mmol/g,鈣結(jié)合率為86%。此條件下制備的FEP-Ca復(fù)合物磷含量為3.78%,氮含量為11.15%,鈣含量為7.27%,氮磷摩爾比為6.53。
　　FEP-Ca復(fù)合物具有較好的酸堿穩(wěn)定性,在pH5-8范圍內(nèi)鈣保留率高達(dá)90%以上。一定的加熱處理會(huì)導(dǎo)致FEP-Ca復(fù)合物鈣保留率下降,經(jīng)過(guò)高溫殺菌后鈣保留率為

4、71.33%。FEP-Ca復(fù)合物具有較高的抗消化性,經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后,鈣保留率為89.69%。磷酸鹽能與FEP競(jìng)爭(zhēng)鈣離子,隨著磷酸鹽濃度的上升,FEP-Ca的鈣保留率顯著下降(p<0.05)。當(dāng)磷酸鹽濃度為30 mM時(shí),鈣保留率降至37.05%。
　　3. FEP-Ca促鈣吸收活性研究
　　缺鈣大鼠飼喂FEP-Ca后,可顯著增加體重、促進(jìn)鈣吸收、維持血鈣和ALP水平穩(wěn)定,增加骨重、骨密度和骨鈣含量,增強(qiáng)骨生物

5、力學(xué)性能,使上述指標(biāo)達(dá)到或優(yōu)于正常對(duì)照組水平。FEP-Ca對(duì)缺鈣大鼠的補(bǔ)鈣效果顯著優(yōu)于CaCO3(p<0.05),而與CPP-Ca無(wú)顯著性差異。FEP-Ca有望成為新型的補(bǔ)鈣制劑。
　　4. FEP中高活性組分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　FEP經(jīng)超濾分離后,將分子量小于5 kDa的組分依次經(jīng)羥基磷灰石層析、分子排阻層析及RP-HPLC分離純化得到高活性組分,經(jīng)ESI-QTOF-MS/MS分析,鑒定其氨基酸序列為(pS)S(pS

6、)AF(pS)(pS)ELAR,分子量為1461 Da,含有5個(gè)絲氨酸,其中有4個(gè)被磷酸化修飾,是一種典型的磷酸肽。
　　5.活性肽鈣結(jié)合機(jī)制研究
　　人工合成高活性組分(IPP),經(jīng)質(zhì)譜和紅外光譜分析表明,生理?xiàng)l件下磷酸基團(tuán)是鈣離子的優(yōu)先結(jié)合部位,1分子IPP能結(jié)合4個(gè)鈣離子,羧酸基團(tuán)未參與鈣離子的結(jié)合。紅外光譜和圓二色譜分析表明,IPP生理?xiàng)l件下完全以無(wú)序狀態(tài)存在。當(dāng)同時(shí)升高 pH(10以上)和鈣離子濃度(3mM以上)后