miR-23a及其靶基因APAF-1在喉癌中的作用和功能研究.pdf

1、目的：
　　喉癌是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)也是致死率最高的頭頸部腫瘤之一，發(fā)病率約占全身腫瘤的1％～5％。流行病學(xué)資料顯示，喉癌在男性中高發(fā)，發(fā)病人群的年齡多在40歲以上，且90％以上的喉癌其臨床病理學(xué)分型為喉鱗狀細(xì)胞癌。盡管喉癌在早期診斷與治療手段方面取得了許多進(jìn)步，但近幾十年來(lái)喉癌患者的五年生存率幾乎沒(méi)有任何變化，其中很重要的原因在于喉癌的早期癥狀不明顯，缺乏可靠的喉癌早期診斷生物標(biāo)記物。因此，喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究將有助于發(fā)現(xiàn)

2、喉癌早期診治、預(yù)后判定的新生物學(xué)標(biāo)志物，為喉癌早期診斷和靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類由19-24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源非編碼單鏈小RNA，屬于非編碼RNA家族的重要成員，是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究表明，在惡性腫瘤中普遍存在miRNAs的異常表達(dá)，且不同惡性腫瘤miRNAs差異性表達(dá)譜也不盡相同。此外，miRNAs表達(dá)水平與腫瘤患者原發(fā)腫瘤的侵襲范圍、病理分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、外科

3、治療和放化療的治療效果及術(shù)后生存時(shí)間均密切相關(guān)。因此，miRNA已成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后判定的重要分子標(biāo)記物。
　　MiR-23a基因是miR-23a/27a/24-2基因簇家族成員，位于19p13.12染色體上。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-24-2在喉癌中異常表達(dá)，參與喉癌細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)節(jié)，因此，推測(cè)處于同一基因簇的miR-23a也會(huì)在喉癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic p

4、rotease activating factor-1，APAF-1)是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)子，在惡性腫瘤中處于失活或者“靜默”狀態(tài)，發(fā)揮抑癌基因作用。通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)APAF-1是miR-23a的潛在靶點(diǎn)之一。因此，筆者推測(cè)miR-23靶向APAF-1參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展。
　　本研究將以喉癌為研究對(duì)象，應(yīng)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)探討miR-23a和APAF-1在喉癌中的作用和臨床意義，鑒定miR-23a的潛在靶基因

5、APAF-1，明確miR-23a是否通過(guò)APAF-1參與喉癌細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程，為以miR-23a為喉癌診治和預(yù)后分子靶標(biāo)的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、中國(guó)人民解放軍463醫(yī)院耳鼻喉科提供喉癌組織及相應(yīng)配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本，均為手術(shù)后剩余組織，組織標(biāo)本的使用經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得患者的知情同意。同時(shí)，獲得患者喉癌組織病理類型、就診和治療經(jīng)過(guò)以及術(shù)后生存情況的完整病歷信息。
　　2、通過(guò)熒

6、光定量RT-PCR技術(shù)(Real-Time PCR)檢測(cè)喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-23a及APAF-1基因mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)APAF-1蛋白表達(dá)水平，并對(duì)二者表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3、通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法鑒定miR-23a與APAF-1 mRNA的3'UTR特異性結(jié)合能力。將miR-23a基因的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞中，檢測(cè)APAF-1表達(dá)的變化情況，進(jìn)一步

7、明確miR-23a在喉癌中對(duì)APAF-1表達(dá)的調(diào)控作用。
　　4、將miR-23a基因和siAPAF-1相關(guān)短片段分別轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwells小室及基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后喉癌細(xì)胞增殖速率、凋亡率、克隆形成能力、遷移及侵襲能力的變化情況，評(píng)估m(xù)iR-23a和APAF-1對(duì)喉癌生物學(xué)行為的影響。
　　5、應(yīng)用單因素方差分析、Kaplan-Meier生存曲線和Cox回

8、歸模型的統(tǒng)計(jì)方法分析miR-23a基因與喉癌患者臨床病理學(xué)特點(diǎn)和生存時(shí)間的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS16.0對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)用于兩組數(shù)據(jù)之間的比較分析。
　　結(jié)果：
　　1、Real-Time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，喉癌組織miR-23a表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著升高(P＜0.05)，APAF-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著下降(P＜0.05)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系

9、(R=-0.697，P=0.025; R=-0.633,P=0.049)。
　　2、單因素方差分析結(jié)果顯示，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高級(jí)別臨床分期（Ⅲ和Ⅳ期）的喉癌患者組織中，miR-23a表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，但在不同年齡、性別、吸煙、飲酒、分化和腫瘤浸潤(rùn)深度亞組中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異。
　　3、Kaplan-Meier生存曲線顯示，miR-23a高表達(dá)組的喉癌患者五年生存率較miR-23a低表達(dá)組顯著降低（秩和檢驗(yàn)P=0.00

10、3）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，miR-23a表達(dá)水平與喉癌患者臨床分期同為喉癌患者預(yù)后的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.001; P=0.001)。
　　4、共同轉(zhuǎn)染APAF-13'非翻譯區(qū)熒光素酶載體及miR-23a模擬物至HEK293細(xì)胞中，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示miR-23a可與APAF-13'非翻譯區(qū)結(jié)合。此外，Western Blot及Real-Time PCR結(jié)果表明miR-2

11、3a能夠顯著降低Hep-2細(xì)胞中APAF-1 mRNA及蛋白水平(P＜0.05)，且與siAPAF-1效果一致，進(jìn)一步證實(shí)miR-23a通過(guò)與APAF-13'非翻譯區(qū)結(jié)合下調(diào)APAF-1表達(dá)。
　　5、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物組能夠顯著增加喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-23a抑制物組則顯著降低喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物

12、組效果相同，siAPAF-1組也能夠顯著增加Hep-2細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)。
　　6、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物的喉癌Hep-2細(xì)胞克隆形成能力顯著提高(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-23a抑制物的喉癌Hep-2細(xì)胞克隆形成能力則顯著降低(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物組效果相同，siAPAF-1組也能夠顯著提高Hep-2細(xì)胞的克隆形成能力(P＜0.05)。
　　7

13、、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-23a抑制物組喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染siAPAF-1組喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)，但轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物組喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡率變化不明顯（P＞0.05）。
　　8、侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組組相比，轉(zhuǎn)染miR-23a模擬物組喉癌Hep-2細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力顯著增加(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-23a抑制劑組