骨髓增生異常綜合征鐵調(diào)素及其相關(guān)因素的研究和APAF-1基因與紅系凋亡在鐵過載中的研究.pdf

1、第一部分骨髓增生異常綜合征患者鐵調(diào)素及其相關(guān)因素的研究
　　鐵調(diào)素在鐵代謝過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，MDS鐵過載患者鐵調(diào)素表達(dá)下降，被認(rèn)為是引發(fā)鐵過載的原因之一。本研究旨在揭示鐵過載、鐵調(diào)素及其相關(guān)因素的相關(guān)性，MDS病例數(shù)為73名，血清鐵調(diào)素（外周血和骨髓）的測定方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）對。生長分化因子15（GDF15）和扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物（TWSG1）基因的mRNA表達(dá)運(yùn)用實時熒光定量PCR法。患者T細(xì)胞CD4+

2、和CD19+表達(dá)及Th細(xì)胞Th1與Th2極化的測定由流式細(xì)胞儀完成。為了評估MDS疾病鐵過載對于心臟和肝臟的影響，24名患者進(jìn)行了MRI T2*檢查。結(jié)合本中心中心實驗室測定的血清鐵蛋白（SF）和C反應(yīng)蛋白（CRP）的資料，將患者進(jìn)行分組、分層、分型后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。73名MDS患者外周血與骨髓血清鐵調(diào)素的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.134）。根據(jù)WHO2008分型分組將患者分為7型，其中難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多型（RARS）鐵

3、調(diào)素表達(dá)水平最低（105.40±5.13 ng/ml），難治性貧血伴原始細(xì)胞增多-1型（RAEB-1）最高（335.71±25.16 ng/ml），7型之間血清鐵調(diào)素的表達(dá)存在顯著差異（P=0.041）。根據(jù)IPSS積分和WPSS積分分組，血清鐵調(diào)素在兩種積分的低危組和高危組之間的均存在差異（P=0.033和P=0.009），SF和GDF15在IPSS積分高危組和低危組之間均無差異（P=0.689和P=0.281），但是在WPSS積分高

4、危組和低危組之間呈現(xiàn)差異（P=0.028和P=0.048）。根據(jù)Th細(xì)胞極化分組，Th高極化組血清鐵調(diào)素水平顯著高于正常極化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。將SF、心臟T2*值和肝臟鐵濃度（LIC）（由肝臟T2*值換算得到）引入與血清鐵調(diào)素相關(guān)的逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，三個因素中LIC與鐵調(diào)素存在相關(guān)性（r=0.582，p<0.001），另外兩個因素?zé)o相關(guān)性。血清鐵調(diào)素表達(dá)與其所有相關(guān)因素做多元相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CRP、LIC與血清

5、鐵調(diào)素存在相關(guān)性。我們將所有患者分為鐵過載組和鐵負(fù)荷正常組，將他們的鐵調(diào)素與GDF15作相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵過載組GDF15與鐵調(diào)素的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.663，P<0.001），鐵負(fù)荷正常組沒有得出良好的相關(guān)性（r=0.199，P=0.275）。血清鐵調(diào)素可以輔助評估MDS鐵過載。MDS患者骨髓與外周血鐵調(diào)素水平無顯著差異。炎癥因素是鐵調(diào)素表達(dá)的關(guān)鍵因素。GDF15是抑制鐵調(diào)素表達(dá)的因素之一。淋巴細(xì)胞的免疫狀態(tài)可能是調(diào)節(jié)鐵調(diào)

6、素表達(dá)的潛在影響因子。LIC結(jié)合鐵調(diào)素對于評估患者臟器鐵負(fù)荷較SF可能更為精確。
　　第二部分鐵過載骨髓增生異常綜合征患者APAF-1基因與紅系凋亡的研究
　　凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1，APAF-1）是固有凋亡途徑中的關(guān)鍵因子。為了研究其在鐵過載骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者中的作用，分別運(yùn)用流式細(xì)

7、胞術(shù)和熒光定量PCR方法對鐵過載組（iron overload group，IO group）和非鐵過載組（non-iron overload group，non-IO group）患者進(jìn)行紅系細(xì)胞凋亡、APAF-1的mRNA水平表達(dá)的檢測。此外，我們構(gòu)建了一個體外鐵過載模型，在培養(yǎng)K562和MDS-L細(xì)胞系的同時加入不同濃度的檸檬酸鐵銨（FAC），觀察 FAC孵育前后紅系細(xì)胞凋亡率、APAF-1 mRNA和蛋白水平表達(dá)的改變，用FAC

8、+DFO（去鐵胺）組作為對照。為了進(jìn)一步證實 APAF-1在紅系凋亡中的作用，我們運(yùn)用一組內(nèi)切核糖核酸酶制備的小干擾 RNA（esiRNAs）在 K562和MDS-L細(xì)胞系中穩(wěn)定沉默APAF-1的表達(dá)，研究沉默前后紅系細(xì)胞凋亡和APAF-1的mRNA水平表達(dá)。結(jié)果顯示鐵過載組患者的紅系凋亡率和APAF-1表達(dá)都高于非鐵過載組（P<0.001和P<0.001）。根據(jù)IPSS分組，低危組患者APAF-1表達(dá)高于高危組（P=0.004），然而

9、根據(jù)IPSS-R分組之后，兩組之間未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.170）。與不同濃度的FAC共孵育后，兩種細(xì)胞系的紅系凋亡率（P<0.001和 P<0.001）和APAF-1表達(dá)升高（P=0.013和P=0.031），同時K562細(xì)胞系G2/M期細(xì)胞比例隨著濃度的升高而下降（P<0.001）。相較于FAC組，兩種細(xì)胞系 FAC+DFO組的紅系凋亡率和 APAF-1表達(dá)有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（K562：P=0.038和P<0.001；M