斜紋夜蛾細(xì)胞Spli Apaf-1蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡通路的研究受到科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注，并且取得了眾多成果。目前研究的較為透徹的是在線蟲(chóng)、果蠅和人類中的細(xì)胞凋亡通路，由于細(xì)胞凋亡事件在進(jìn)化過(guò)程中的保守性，它們存在著許多相似的地方，但也有許多進(jìn)化上的分歧引發(fā)的不同。最具保守性的是內(nèi)源性線粒體凋亡通路，以哺乳動(dòng)物為例，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞色素C從線粒體的內(nèi)外膜間質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，跟位于細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合引起其聚合形成凋亡體復(fù)合物，繼而募集起始Caspase9酶原并活化形成一

2、個(gè)大型的蛋白水解機(jī)器，切割活化效應(yīng)Caspase引起凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而在對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)凋亡通路的研究中卻發(fā)現(xiàn)了與進(jìn)化上相近的果蠅凋亡通路中相左事件，即內(nèi)源性通路起始因子細(xì)胞色素C在該通路中是否參與的問(wèn)題。凋亡體復(fù)合物是內(nèi)源性線粒體通路的中心，而其組裝亞單位Apaf-1更是該通路的核心蛋白，對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)Apaf-1的研究將為進(jìn)一步揭示昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡通路的分子機(jī)制提供條件。本研究首先制備了斜紋夜蛾細(xì)胞Apaf-1蛋白的多克隆抗體，并運(yùn)用該抗體

3、對(duì)Apaf-1蛋白的功能進(jìn)行初步研究。
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的斜紋夜蛾Apaf-1SNP序列，選取其中一段編碼147個(gè)氨基酸的保守序列作為目的片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b-Apaf1N147，表達(dá)并純化融合蛋白His-Apaf1N147，免疫兔子制備多克隆抗血清，然后以親和層析的方法純化所獲得的抗血清并通過(guò)Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，制備并純化后的抗體可以特異性結(jié)合原核表達(dá)的Apaf-1抗原蛋白和斜紋夜蛾內(nèi)源的A

4、paf-1蛋白。斜紋夜蛾Apaf-1兔多克隆抗體的制備，為進(jìn)一步研究鱗翅目昆蟲(chóng)Apaf-1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力的條件;同時(shí)，我們也提出了一個(gè)快速高效純化多克隆抗體的方案。
　　通過(guò)免疫熒光，我們利用所制備的Apaf-1兔多克隆抗體以及帶有FITC標(biāo)簽的熒光二抗，以BSA作為對(duì)照間接地鑒定了這個(gè)蛋白在斜紋夜蛾細(xì)胞中的定位，結(jié)果顯示它定位在胞質(zhì)中。為了更進(jìn)一步研究Apaf-1蛋白在鱗翅目昆蟲(chóng)凋亡通路中的作用，需要將該蛋白的ORF

5、正確地?cái)U(kuò)增出來(lái)并外源表達(dá)。我們通過(guò)改變擴(kuò)增體系中Mg2+濃度和退火溫度以高保真KOD酶最終經(jīng)過(guò)雙輪PCR獲得了Apaf-1的ORF全長(zhǎng)，將其連接到原核表達(dá)載體上進(jìn)行原核表達(dá)嘗試，結(jié)果未獲得完整正確表達(dá)的Apaf-1蛋白。之后我們構(gòu)建真核表達(dá)載體pIE1-Apaf-1-EGFP并將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜紋夜蛾細(xì)胞中，并在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源的融合蛋白Apaf-1-GFP在斜紋夜蛾細(xì)胞中得以表達(dá)并且表達(dá)了的融

6、合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，這與免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。
　　用免疫共沉淀技術(shù)通過(guò)抗原抗體之間相互作用以及Protein G與抗體IgG之間特異的相互作用將斜紋夜蛾胞質(zhì)蛋白中能夠與Cyto C相互作用的Apaf-1蛋白沉淀下來(lái)并通過(guò)western blot檢測(cè);用pull-down技術(shù)通過(guò)掛在Ni-NTA樹(shù)脂上的原核表達(dá)的融合蛋白His-Cyto C將斜紋夜蛾胞質(zhì)蛋白中能與細(xì)胞色素C相互作用的Apaf-1蛋白留滯在Ni-NTA樹(shù)脂上

7、，然后通過(guò)western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在斜紋夜蛾細(xì)胞凋亡的線粒體內(nèi)源性通路中存在Apaf-1蛋白和Cyto C之間的相互作用。之后我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIE1-EGFP-Cyto C和pIE2-Apaf-1-Cherry，然后將它們同時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜紋夜蛾細(xì)胞并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞發(fā)生凋亡并且紅色代表的Apaf-1蛋白和綠色代表的Cyto C蛋白存在基本的共定位現(xiàn)象。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步肯定了