果蠅miR-124功能研究及靶基因篩選.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長度約21～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA。通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式miRNA特異結(jié)合于靶mRNA3’UTR(3’非編碼區(qū))，導(dǎo)致其降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在生物體生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。近年來，microRNA的研究成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　miR-124是一種神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)的miRNA。miR-124在包括果蠅、小鼠、人等各物種中普遍存在，且序列高度保守

2、。已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-124參與了不同物種神經(jīng)發(fā)育的調(diào)控。我們利用果蠅為模型，探究miR-124在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期工作主要包括miR-124過表達(dá)和功能缺失動(dòng)物模型的建立。前期研究表明，miR-124于神經(jīng)系統(tǒng)過表達(dá)將導(dǎo)致果蠅眼發(fā)育異常，而將miR-124敲除后，果蠅的攀爬、飛行、生育以及產(chǎn)卵能力等各方面均出現(xiàn)缺陷?；谶@些結(jié)果，我們想研究miR-124過表達(dá)和敲除后對(duì)果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的影響，并篩選miR-1

3、24作用的靶基因，進(jìn)而闡明miR-124在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中所起作用及其分子機(jī)制。
　　首先，我們運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)miR-124突變體和過表達(dá)果蠅17期胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，盡管miR-124在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，敲除和過表達(dá)miR-124后我們未在中樞神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)上發(fā)現(xiàn)明顯異常。
　　隨后，我們對(duì)敲除和過表達(dá)miR-124后果蠅三齡幼蟲的外周神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了分析。我們發(fā)現(xiàn)，miR-124對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)作用

4、顯著，其中神經(jīng)肌肉接頭(NMJ6/7)的分支長度、突觸囊泡(bouton)數(shù)量以及ddaE神經(jīng)元分支數(shù)目在過表達(dá)和敲除miR-124后均顯著下降，提示miR-124在維持突觸正常發(fā)育以及樹突形態(tài)穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用。
　　最后，我們經(jīng)過生物信息學(xué)分析和初步實(shí)驗(yàn)，篩選出tailless很可能是miR-124的靶基因。因此，我們制備了tailless的多克隆抗體，并通過western blotting在蛋白水平上驗(yàn)證了miR-12