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1、目的:近年來(lái),隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高,生活方式的改變,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為我國(guó)導(dǎo)致慢性肝病的重要原因之一,其中,非酒精性單純性脂肪肝是一種良性病變,而非酒精性脂肪性肝炎則會(huì)進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病。目前,NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,已有一些研究表明,肝細(xì)胞凋亡是促進(jìn)其進(jìn)展的重要病理生理改變,且程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),但其中的機(jī)制仍未完
2、全闡明。研究證實(shí),過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激易導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙及細(xì)胞凋亡,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶或許可以影響此過(guò)程。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的分子伴侶,在NAFLD中PDI是否可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程,目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)的方法,探索PDI在此過(guò)程中所起的作用,同時(shí)試圖闡明其可能的機(jī)制。
方法:⑴細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:HL-7
3、702細(xì)胞用加入了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。傳代至狀態(tài)良好時(shí),消化后鋪至12孔板中,按LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。72h后改用1mM FFA高脂培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑵油紅O染色:吸去培養(yǎng)基,用PBS輕柔漂洗后加入12%中性甲醛固定15min,然后用油紅稀釋液染色15min,60%異丙醇漂洗后用蘇木素復(fù)染5min,顯微鏡下觀察并拍照。⑶Western
4、 Blot檢測(cè):收集12孔板中的細(xì)胞并提取蛋白,將各組蛋白加入相應(yīng)泳道后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉1 h,一抗4℃孵育過(guò)夜,再用二抗孵育后行ECL法檢測(cè),最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。⑷細(xì)胞凋亡檢測(cè):細(xì)胞用冷的PBS洗兩次并重懸后,加入適量的AnnexinⅤ和PI染色,混勻后避光孵育15min,孵育后加入1×buffer400ul,用流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。
結(jié)果:①油紅O染色:與對(duì)照組相比,FFA脂
5、變誘導(dǎo)組細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量紅染的脂滴,但經(jīng)高脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)的三組,即單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negativesiRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組組間差異不明顯。②細(xì)胞凋亡結(jié)果:與對(duì)照組相比,單純FFA誘導(dǎo)組、PDI—negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組、PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的細(xì)胞凋亡比例依次升高。③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)指標(biāo):與對(duì)照組相比,GRP78在單純FFA誘導(dǎo)組、PDI—neg
6、ative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的表達(dá)均增高,并以PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組增高最明顯。而CHOP在對(duì)照組、單純FFA誘導(dǎo)組、PDI-negative siRNA+FFA誘導(dǎo)組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導(dǎo)組的表達(dá)是依次增高的。另外,IRE1在各組表達(dá)情況無(wú)明顯差異。
結(jié)論:⑴PDI表達(dá)下調(diào)能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度;⑵PDI表達(dá)下調(diào)能加重由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)
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