井崗霉素的生物合成及途徑改造.pdf

1、井岡霉素是一類氨基環(huán)醇類抗生素，包含一個(gè)有效烯胺結(jié)構(gòu)，在亞洲被廣泛應(yīng)用于水稻紋枯病的防治，同時(shí)也用于有效烯胺的化學(xué)合成，有效烯胺進(jìn)而作為治療二型糖尿病藥物伏格列波糖的前體。井岡霉素的生物合成途徑的闡明對于更加有效的利用這一化合物有重要的意義。在前期工作中，井岡霉素的生物合成基因簇已得到克隆并測序。測序的區(qū)域共45kb，通過BLAST分析確定了27個(gè)開放閱讀框。為確定此基因簇的正確性及完整性，我們將分別包含valABC和valKLMN的兩

2、個(gè)操縱子克隆到一個(gè)整合型載體pSET152上，并轉(zhuǎn)入異源宿主變鉛青鏈霉菌1326中。在整合了以上七個(gè)基因的變鉛青鏈霉菌衍生菌株的發(fā)酵液中檢測到了有效氧胺A。進(jìn)一步將編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因vaIG轉(zhuǎn)入此衍生菌株中，發(fā)酵后檢測到了井岡霉素A的產(chǎn)生。此結(jié)果說明valABCKLMN這七個(gè)基因能夠滿足有效氧胺A的合成，而ValG是負(fù)責(zé)最后一步將有效氧胺A糖基化合成井岡霉素A的糖基轉(zhuǎn)移酶。 在井岡霉素A的合成途徑中，前期研究證實(shí)ValA是負(fù)責(zé)

3、催化磷酸戊糖途徑中的7-磷酸景天庚酮糖轉(zhuǎn)化為2-表-5-表-有效醇酮的環(huán)化酶，是井岡霉素A合成途徑中的第一步。而在本研究中通過體外酶活實(shí)驗(yàn)確認(rèn)功能基因ValD是表異構(gòu)化酶，負(fù)責(zé)催化2-表-5-表-有效醇酮異構(gòu)化生成5-表-有效醇酮。當(dāng)以7-磷酸景天庚酮糖為底物，ValA單獨(dú)存在時(shí)，只生成2-表-5-表-有效醇酮；當(dāng)ValA與ValD同時(shí)存在時(shí)生成5-表-有效醇酮。序列分析發(fā)現(xiàn)它屬于VOC家族。類似于此家族的其它成員，ValD的每個(gè)活性位

4、點(diǎn)分別由兩個(gè)βαβββ模塊構(gòu)成；ValD的單聚體具有兩個(gè)活性位點(diǎn)，且以二聚體的形式存在，因此它是VOC家族中目前發(fā)現(xiàn)的最大的成員。 前期工作證實(shí)有效烯酮和有效酮是反應(yīng)的中間產(chǎn)物，激酶ValC可以將這兩個(gè)化合物磷酸化。但是其他中間產(chǎn)物沒有被分離到或經(jīng)過嚴(yán)格的體外酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)。氧化還原酶基因valN的缺失突變株發(fā)酵可產(chǎn)生1，1'-雙-有效烯胺和有效烯霉素，分別比有效氧胺A和井岡霉素A多了一個(gè)雙鍵，表明ValN負(fù)責(zé)催化井岡霉素A中C-

5、5/C-6位的雙鍵的還原，以有效烯酮或者7-磷酸有效烯酮為底物催化合成有效酮或者7-磷酸有效酮。 唯一負(fù)責(zé)編碼轉(zhuǎn)氨酶的基因valM的缺失突變株發(fā)酵不能產(chǎn)生井岡霉素A或者有效氧胺A，表明它和井岡霉素合成相關(guān)，推測它負(fù)責(zé)井岡霉素A中氮原子的引入，以7-磷酸有效酮為底物催化合成7-磷酸有效胺。 BLAST分析表明ValB是ADP轉(zhuǎn)移酶，本研究中以化學(xué)合成的不同底物做酶活分析。結(jié)果表明ValB以ATP為核苷供體，負(fù)責(zé)催化1-磷酸

6、有效烯醇生成ADP-有效烯醇，所以1-磷酸有效烯醇和ADP-有效烯醇都是合成途徑中的中間產(chǎn)物。與ValB有60％同源性的來自阿卡波糖合成途徑的NTP轉(zhuǎn)移酶AcbR以ATP或者GTP作為核苷供體，也利用1-磷酸有效烯醇作為底物，生成ADP-有效烯醇或者GDP-有效烯醇。 在糖基轉(zhuǎn)移酶ValG的體外酶活實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它除了UDP-葡萄糖之外，還可以利用非天然的糖基供體UDP-半乳糖催化合成新的化合物4"-表井岡霉素A，該化合物具有一定的