米多霉素生物合成機(jī)理的研究.pdf

1、上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文米多霉素生物合成機(jī)理的研究姓名：李力申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：鄧子新20081101上海交通大學(xué)博士論文米多霉素生物合成機(jī)理的研究來源。用穩(wěn)定性同位素C。。6個(gè)碳原子全標(biāo)記的精氨酸喂養(yǎng)生裂鏈輪絲菌，其發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了分子量為520的米多霉素，含量比本底水平增高5倍，而非標(biāo)記的米多霉素分子量為514。同時(shí)，高分辨二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中所有包含胍基側(cè)鏈的斷裂碎片都比未喂養(yǎng)的對(duì)應(yīng)部分分子量增高了6，表明標(biāo)記的6

2、個(gè)碳原子在精氨酸或者其衍生物與葡萄糖醛酸縮合過程中全部保留了下來，脫羧反應(yīng)去掉的是葡萄糖醛酸羧基碳。所以，米多霉素葡萄糖殘基C6原子來源于精氨酸而不是葡萄糖。為了系統(tǒng)的提出米多霉素完整的生物合成途徑，我們結(jié)合異源表達(dá)和系統(tǒng)突變，首先確定了米多霉素生物合成基因簇的左右兩個(gè)邊界分別位于orflmilA與milQ—orf十j之間，對(duì)其中包括的17個(gè)Drf一一進(jìn)行突變，除了milL突變沒有影響之外，證明其它的16個(gè)基因與米多霉素的生物合成相關(guān)。

3、milG編碼的是一個(gè)新穎的RadicalSAM家族蛋白，它是唯一一個(gè)氧化還原酶候選基因，負(fù)責(zé)羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸C4位上羥基氧化成羰基，在milG突變株的發(fā)酵液中，中間產(chǎn)物羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸大量積累，這充分證明了其功能就是負(fù)責(zé)這一步關(guān)鍵的催化反應(yīng)，這也是第一次在核苷類抗生素生物合成中報(bào)道的新型氧化酶基因。分別敲除兩個(gè)氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶基因mile和mild突變株都喪失了產(chǎn)生米多霉素的能力，推測這兩個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶可能負(fù)責(zé)糖上的C2C

4、3間雙鍵的形成。可能編碼天冬氨酸／酪氨酸／芳香族氨基酸類氨基轉(zhuǎn)移酶的milg和編碼二氫吡啶甲酸合酶的milN基因的突變株均不能夠再產(chǎn)生米多霉素，MilM可能參與催化精氨酸Q位的氨基轉(zhuǎn)化成羰基而形成Q一酮酸，而MilN則負(fù)責(zé)Q一羰基與脫羧后的己糖碳負(fù)離子之間的縮合。編碼degT／dnrJ／eryCl／strS類氨基轉(zhuǎn)移酶的milD和編碼可能的連接酶功能的milH突變株都喪失了產(chǎn)生米多霉素的能力，推測前者是負(fù)責(zé)C4位上羰基的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，后者負(fù)

5、責(zé)將激活的絲氨酸連接到C4位的氨基上，形成類似肽鍵的酰胺鍵。而中斷LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因milO也消除了米多霉素的生產(chǎn)，說明它可能是一個(gè)途徑專一性的調(diào)節(jié)基因。MilJ顯示與Ubiquitone的羥甲基化酶有一定的同源性，可能負(fù)責(zé)精氨酸的gamma羥化；而MilI可能負(fù)責(zé)了絲氨酸的活化；ABCtransporter基因milP的突變株也不產(chǎn)米多霉素，它很可能是米多霉素的抗性基因：編碼MajorFacilitatorSuperfam