阿霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因的異源表達(dá).pdf

1、阿霉素具有強(qiáng)烈的生物化學(xué)效應(yīng)，是臨床上的一種重要抗腫瘤藥物。阿霉素可由Streptomyces peucetius ATCC27952天然微量合成;傳統(tǒng)的化學(xué)法大規(guī)模合成阿霉素因其成本高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)而制約了該藥的生產(chǎn)。阿霉素高產(chǎn)菌株的篩選一直是該藥生物合成法的研究熱點(diǎn)。在這些研究中，基因工程則表現(xiàn)出良好前景，特別是近年來合成生物學(xué)的快速發(fā)展。本研究則指向阿霉素關(guān)鍵酶基因的異源表達(dá)，以期實(shí)現(xiàn)阿霉素代謝通路的異源化構(gòu)建，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)阿霉素

2、的異源菌株的從頭合成。具體內(nèi)容包括:
　　1、針對阿霉素生物途徑長、涉及關(guān)鍵酶基因繁多，以商業(yè)化的pET-28a載體為基礎(chǔ)，將該載體的T7啟動(dòng)子前的XbaⅠ酶切位點(diǎn)失活，并在其后面加一個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn);在T7終止子后加一個(gè)SpeⅠ酶切位點(diǎn)。構(gòu)建出多基因串聯(lián)共表達(dá)載體，并命名為pBD，方便后續(xù)多基因的共表達(dá);
　　2、利用基因組提取試劑盒提取了S.peucetius基因組，用PCR克隆技術(shù)克隆并構(gòu)建阿霉素合成關(guān)鍵酶基因的T載

3、體，然后構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株，實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)?？寺×税⒚顾靥烊缓铣赏緩街胸?fù)責(zé)成鏈、成環(huán)以及成環(huán)后糖基化及其修飾基因共16個(gè)，依次為dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsE、dpsF、dpsG、dnrG、dpsY、dnrC、dnrD、dnrE、dnrF、doxA、dnrK、dnrP，表達(dá)了成鏈過程中關(guān)鍵酶基因依次為dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsE、dpsF、dpsG、dnrG、dpsY,

4、其中dpsA、dpsC、dpsE、dpsF、dpsY、dnrG正常表達(dá)。
　　3、考慮到外源基因過表達(dá)往往降低工程菌的生物量，而生物量的積累往往會促進(jìn)產(chǎn)量的提高;而大腸桿菌與克雷伯氏菌(Klebsiella.AA405)遺傳背景非常相似，研究了Klebsiella.AA405自身生長基因的過表達(dá)對甘油代謝途徑中1，3-丙二醇、2，3-丁二醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與攜帶空質(zhì)粒重組菌相比，過表達(dá)編碼核糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)酶的rbsC基因工程菌