美達(dá)霉素生物合成途徑中調(diào)控基因med-ORF10作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、鏈霉菌AM-7161(Streptomyces sp.AM-7161)能產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物美達(dá)霉素(medermycin)。美達(dá)霉素是一種聚酮類(lèi)抗生素，具有潛在的抗菌抗腫瘤生物學(xué)活性。在美達(dá)霉素的生物合成基因簇中，med-ORF10基因是一個(gè)功能未知基因，前期研究推測(cè)其參與美達(dá)霉素合成的調(diào)控作用。本文圍繞med-ORF10基因的調(diào)控機(jī)制展開(kāi)初步研究，具體包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.med-ORF10對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控
　　

2、 前期半定量PCR實(shí)驗(yàn)已初步得出med-ORF10對(duì)同一基因簇中的酮基還原酶編碼基因med-ORF12存在一定的調(diào)控作用。在這里我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步量化其調(diào)控效果:選取了美達(dá)霉素基因簇異源表達(dá)菌株CH999/pIK340（異源野生菌株）和敲除了med-ORF10的突變菌株CH999/pAYT64（異源突變菌株），提取兩者的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以看家基因23S rRNA基因作為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)“異

3、源野生菌株”和“異源突變菌株”中med-ORF12基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，med-ORF12在“異源突變菌株”中較“異源野生菌株”轉(zhuǎn)錄水平下降了約5倍，這與前期推測(cè)med-ORF10為一正調(diào)控基因相符，表明此基因在美達(dá)霉素合成基因簇中行使著重要的調(diào)控作用。
　　 2.med-ORF10基因的原核表達(dá)和抗體制備
　　 為了能進(jìn)一步研究med-ORF10的調(diào)控機(jī)制，我們對(duì)med-ORF10基因進(jìn)行原核表達(dá)和多克隆抗

4、體的制備。
　　 首先從含有美達(dá)霉素合成全基因簇的pIK340質(zhì)粒上PCR得到med-ORF10基因，將其克隆到pT7Blue載體上，亞克隆至表達(dá)載體pET28a(+)上，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21(DE3)中，構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pHSL79。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件獲得高表達(dá)的可溶性Med-ORF10蛋白，大量純化Med-ORF10蛋白，將純化的Med-ORF10蛋白多次免疫新西蘭大白兔和昆明小鼠制備多克隆抗體，通過(guò)W

5、esternblot檢測(cè)抗體的特異性較高。
　　 3.研究Med-ORF10蛋白與靶基因啟動(dòng)子的相互作用
　　 前期實(shí)驗(yàn)表明，med-ORF10基因是一個(gè)正效轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，調(diào)節(jié)的靶基因之一為med-ORF12，且調(diào)控效果非常明顯，但具體調(diào)控機(jī)制也還未確定。我們?cè)噲D通過(guò)凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)Med-ORF10蛋白是否與med-ORF12的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控作用。
　　 首先得到med-ORF12