雌二醇對卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞株增殖侵襲的影響及ARID1A、p53、MMP9蛋白表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的：上皮性卵巢癌(EpithelialOvarianCancer，EOC)是女性三大惡性腫瘤之一，目前標(biāo)準(zhǔn)的治療方案是徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及以鉑類為基礎(chǔ)的化療。流行病學(xué)調(diào)查顯示，EOC患者多數(shù)已絕經(jīng)，但仍有40％左右的年輕患者因?yàn)槭中g(shù)或放化療而導(dǎo)致過早的醫(yī)源性絕經(jīng)。醫(yī)源性絕經(jīng)比自然絕經(jīng)對年輕婦女的影響更為強(qiáng)烈，主要涉及潮熱、出汗、陰道萎縮、性交困難、失眠、焦慮、抑郁，甚至引起骨質(zhì)疏松、骨折和心血管疾病等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降及非癌癥死

2、亡率的增加。雌激素作為絕經(jīng)激素治療（MHT）的一部分，對于治療絕經(jīng)綜合征、預(yù)防骨質(zhì)疏松等，尤其是對于絕經(jīng)前的卵巢癌患者經(jīng)過手術(shù)或者化療之后，雌激素水平突然低落引起的絕經(jīng)癥狀，具有顯著效果。
　　目前，EOC的發(fā)病原因及機(jī)理仍不明了。一些研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能涉及癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡抑制以及細(xì)胞周期失調(diào)等其中一種或多種基因的變化。關(guān)于抑癌基因突變引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究一直受到關(guān)注，ARID1A作為染色質(zhì)重塑復(fù)合物SW

3、I/SNF的一個(gè)亞基，在多種惡性腫瘤中存在突變，尤其是在卵巢透明細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。有研究顯示ARID1A可能與PI3K途徑存在相互作用，影響Akt的磷酸化水平，從而控制腫瘤細(xì)胞的增殖。降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要步驟，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase--9，MMP9)是依賴Zn2?的基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，又稱明膠酶B，它主要作用于Ⅳ、V、Ⅶ、X、Ⅺ型膠原以

4、及蛋白多糖、彈性蛋白和纖維連接蛋白等，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜達(dá)到侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。p53是在婦科惡性腫瘤中突變率較高的抑癌基因，野生型p53蛋白具有調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成及促進(jìn)DNA修復(fù)等作用。有研究顯示p53蛋白陽性率在卵巢癌組織中與癌旁正常組織存在顯著的差異性，提示p53蛋白異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)和發(fā)展聯(lián)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)p53可以與ARID1A/BRG1形成復(fù)合物并調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，也可以同ARID1

5、A的羧基端相互作用，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。有研究顯示卵巢透明細(xì)胞癌的發(fā)生與雌激素作用有一定關(guān)系，但是對于雌激素是否引起卵巢透明細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的研究較少，雌激素在卵巢透明細(xì)胞癌患者術(shù)后的臨床安全應(yīng)用仍然存在很多爭論。
　　本實(shí)驗(yàn)通過檢測不同濃度17β-雌二醇（E2）作用于卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖、侵襲、移行能力變化及ARID1A、p53、MMP9蛋白表達(dá)的情況，嘗試探索雌激素對卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞可能存在的影響，為

6、卵巢透明細(xì)胞癌患者術(shù)后雌激素應(yīng)用的安全性提供理論依據(jù)。
　　方法:用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、飽和濕度5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對照組（不含E2及溶劑）、溶劑對照組（加入0.01%vDMSO）以及E2組（10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L、10-1

7、1mol/L）。E2作用于ES2細(xì)胞前改用不含血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞24h。實(shí)驗(yàn)至少分別重復(fù)3次。
　　1、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTS法）：對ES2細(xì)胞以不同濃度的E2（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）作用不同時(shí)間（24h，48h，72h），同時(shí)設(shè)空白對照組和溶劑對照組并觀察兩個(gè)對照組的區(qū)別。以細(xì)胞貼壁后，最初更換各組培養(yǎng)基的時(shí)間為0h，分

8、別在更換各組細(xì)胞培養(yǎng)基的24h、48h、72h，按10μl/孔加入MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1~4h。酶標(biāo)儀檢測各孔490nm處的吸光度值，進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
　　2、細(xì)胞移行能力實(shí)驗(yàn)：取實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞接種于transwell小室，每組設(shè)3復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，取出transwell小室，經(jīng)甲醇固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下（200×）計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞，33%醋酸進(jìn)行抽提脫色10min，洗脫液在酶標(biāo)儀

9、上570nm處檢測吸光度值。用于評估細(xì)胞的移行能力。
　　3、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前先將50mg/LMatrigel膠按1:8稀釋，用稀釋液包被transwell小室底部聚碳酸酯膜的上室面，實(shí)驗(yàn)組和對照組ES2細(xì)胞接種于上室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下（200×）計(jì)數(shù)移至膜下層的細(xì)胞數(shù)評估細(xì)胞的侵襲能力。
　　4、蛋白印跡法（Westernblot）檢測對照組及不同濃度E2（10-7mol/

10、L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）作用不同時(shí)間（48h，72h）后，ARID1A蛋白、p53蛋白和MMP9蛋白的表達(dá)。
　　5、應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s描述，多組間均數(shù)差異性比較應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析（One-WayANOVA），若差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK法進(jìn)行組間的多重比較,所有假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

11、。
　　結(jié)果:
　　1、MTS檢測E2作用于各組細(xì)胞24h、48h、72h后細(xì)胞的增殖能力，檢測的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，各組OD值經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示P均小于0.05，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組OD值差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步對24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各組利用SNK法進(jìn)行多重比較，各E2濃度（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）作用的ES2細(xì)胞

12、株與對照組相比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），呈現(xiàn)增殖能力增加。每一時(shí)間點(diǎn)的溶劑對照組與空白對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。24h的時(shí)候，各濃度（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L）之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；48h和72h時(shí)，各濃度（10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L

13、）之間均有差別，增殖能力隨著E2濃度增加而增加（P<0.05）。見表1。
　　2、不同濃度的E2處理細(xì)胞后，檢測24h移行細(xì)胞吸光度值，經(jīng)完全隨機(jī)方差分析結(jié)果顯示P小于0.05，各組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。Transwell移行實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組（73±6.2、65±4.7、61±3.5、58±1.1、58±2）穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)均多于對照組（46±1.5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。
　　3、Tr

14、answell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，經(jīng)過不同濃度E2處理的ES2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)多于對照組，經(jīng)完全隨機(jī)方差分析結(jié)果顯示P小于0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表3。
　　4、Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測各組ARID1A、p53和MMP9蛋白的表達(dá)水平：隨著E2濃度的升高，ARID1A的表達(dá)水平逐漸降低，MMP9和p53蛋白的表達(dá)隨著E2濃度的升高而增加。
　　結(jié)論:
　　1、E2處理ES2細(xì)胞后，細(xì)胞的增