雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞雄激素受體靶基因的篩選和初步鑒定.pdf

1、目的：
　　篩選雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP-AI的雄激素受體靶基因并予以初步鑒定
　　方法：
　　選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP-AI作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將其傳代于多個(gè)15cm培養(yǎng)皿，待生長(zhǎng)至約60％時(shí)換液培養(yǎng)，72h后加入10nMDHT，24h后收集細(xì)胞，使用抗雄激素受體抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，富集得到雄激素受體結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)富集物中PSA基因的相對(duì)含量并計(jì)算其相對(duì)

2、富集度以判斷AR-ChIP實(shí)驗(yàn)效率。對(duì)ChIP富集物進(jìn)行高通量測(cè)序分析，將質(zhì)控合格的測(cè)序結(jié)果與參考基因組比對(duì)，比對(duì)上唯一位置的序列用于后續(xù)(peak峰相關(guān)基因分析、GO分析等)標(biāo)準(zhǔn)信息分析及個(gè)性化分析。選擇PTGER3、FOXP2、FN1、ZNF438、PDE9A、BDNF、PCDH15基因作進(jìn)一步驗(yàn)證與研究:收集去勢(shì)培養(yǎng)72h+10nM DHT處理后0h、3h、6h、9h、24h、48h的LNCaP細(xì)胞和LNCaP-AI細(xì)胞，提取RN

3、A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上述7個(gè)基因在兩株細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　ChIP富集物中PSA基因的相對(duì)富集度為4.71％，富集物總量為0.4671μg，富集物中染色質(zhì)片段主峰小于500bp。將測(cè)序結(jié)果clean data與Hg19序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)到參考基因組唯一位置的reads為10056037條，唯一比對(duì)率為88.08％。唯一比對(duì)reads在各基因功能元件上的分布為:基因間區(qū)58.26％，基因內(nèi)含子

4、區(qū)38.96％，基因上游20K11.98％，基因下游20K11.66％，基因外顯子區(qū)2.11％。使用MACS軟件進(jìn)行peak區(qū)掃描，共得到2876個(gè)peak(p-value＜1e-05)，peak平均長(zhǎng)度為673bp，Peak在各基因功能元件上的分布特征與唯一比對(duì)reads的分布類似。將peak序列定位到基因組，共有1865個(gè)靶基因，其中fold enrichment≥10的基因有425個(gè)。對(duì)peak相關(guān)基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞、細(xì)胞

5、成分、細(xì)胞過(guò)程、結(jié)合、細(xì)胞器相關(guān)的基因位列前五;對(duì)peak相關(guān)基因進(jìn)行pathway分析發(fā)現(xiàn)與基底粘附、代謝途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤調(diào)節(jié)、嘌呤代謝等信號(hào)通路相關(guān)的靶基因占大多數(shù)。與DHT刺激0h相比，DHT刺激可改變7個(gè)AR靶基因在LNCaP-AI細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)，且隨著DHT刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)差異越明顯。各靶基因的相對(duì)表達(dá)量在兩株細(xì)胞間均具有差異，與LNCaP細(xì)胞相比，表達(dá)升高的基因?yàn)镻TGER3、FN1、ZNF438、F