雄激素非依賴性前列腺癌細胞雄激素受體靶基因的篩選和初步鑒定.pdf

1、目的：
　　篩選雄激素非依賴性前列腺癌細胞LNCaP-AI的雄激素受體靶基因并予以初步鑒定
　　方法：
　　選擇生長狀態(tài)良好的雄激素非依賴性前列腺癌細胞LNCaP-AI作為實驗對象，將其傳代于多個15cm培養(yǎng)皿，待生長至約60％時換液培養(yǎng)，72h后加入10nMDHT，24h后收集細胞，使用抗雄激素受體抗體進行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗，富集得到雄激素受體結(jié)合位點。實時熒光定量PCR檢測富集物中PSA基因的相對含量并計算其相對

2、富集度以判斷AR-ChIP實驗效率。對ChIP富集物進行高通量測序分析，將質(zhì)控合格的測序結(jié)果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續(xù)(peak峰相關(guān)基因分析、GO分析等)標準信息分析及個性化分析。選擇PTGER3、FOXP2、FN1、ZNF438、PDE9A、BDNF、PCDH15基因作進一步驗證與研究:收集去勢培養(yǎng)72h+10nM DHT處理后0h、3h、6h、9h、24h、48h的LNCaP細胞和LNCaP-AI細胞，提取RN

3、A進行逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR檢測上述7個基因在兩株細胞中的相對表達量。
　　結(jié)果：
　　ChIP富集物中PSA基因的相對富集度為4.71％，富集物總量為0.4671μg，富集物中染色質(zhì)片段主峰小于500bp。將測序結(jié)果clean data與Hg19序列進行比對，比對到參考基因組唯一位置的reads為10056037條，唯一比對率為88.08％。唯一比對reads在各基因功能元件上的分布為:基因間區(qū)58.26％，基因內(nèi)含子

4、區(qū)38.96％，基因上游20K11.98％，基因下游20K11.66％，基因外顯子區(qū)2.11％。使用MACS軟件進行peak區(qū)掃描，共得到2876個peak(p-value＜1e-05)，peak平均長度為673bp，Peak在各基因功能元件上的分布特征與唯一比對reads的分布類似。將peak序列定位到基因組，共有1865個靶基因，其中fold enrichment≥10的基因有425個。對peak相關(guān)基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)與細胞、細胞

5、成分、細胞過程、結(jié)合、細胞器相關(guān)的基因位列前五;對peak相關(guān)基因進行pathway分析發(fā)現(xiàn)與基底粘附、代謝途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄錯誤調(diào)節(jié)、嘌呤代謝等信號通路相關(guān)的靶基因占大多數(shù)。與DHT刺激0h相比，DHT刺激可改變7個AR靶基因在LNCaP-AI細胞和LNCaP細胞中的表達，且隨著DHT刺激時間的延長，表達差異越明顯。各靶基因的相對表達量在兩株細胞間均具有差異，與LNCaP細胞相比，表達升高的基因為PTGER3、FN1、ZNF438、F