雄激素剝奪激活前列腺癌細(xì)胞PP1依賴的雄激素受體表達(dá)的研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是歐美國(guó)家男性最常見的惡性腫瘤之一，占男性腫瘤相關(guān)死亡的第二位，已成為全世界男性主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在我國(guó)，隨著人們生活水平、健康意識(shí)的提高及醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，前列腺癌的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)。早期(局限性)前列腺癌的治療以外科手術(shù)切除為主；晚期前列腺癌的治療則以內(nèi)分泌治療及聯(lián)合放化療為主，目前被廣泛認(rèn)可的內(nèi)分泌治療為雄激素剝奪治療(Androgen deprivation therap

2、y，ADT)；ADT可以使90％的患者PSA水平維持在較低水平，起初絕大多數(shù)患者對(duì)其治療敏感，但是在治療后2-3年內(nèi)激素敏感型前列腺癌不可避免的進(jìn)展為更具侵襲性的去勢(shì)抵抗型前列腺癌(Castration resistant prostate cancer，CRPC）。CRPC目前普遍的研究顯示：雄激素剝奪條件下，雄激素受體(Androgen receptor，AR)持續(xù)激活對(duì)于維持去勢(shì)條件下腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。磷蛋白磷酸酶(Phos

3、pho-protein phosphatase，PPPs)正成為AR一個(gè)重要的調(diào)控因子，前期研究結(jié)果顯示：雄激素存在的條件下，蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase1，PP1)可以明顯刺激AR激活。目前我們的研究確定了(雄激素剝奪條件下)PP1依賴的AR表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活。在機(jī)制方面，闡明了PP1與AR相互作用主要由AR的配體結(jié)合域(Ligand binding domain，LBD)介導(dǎo)，該結(jié)構(gòu)域也介導(dǎo)著AR主要的泛素化修飾

4、及其降解作用。PP1依賴的AR表達(dá)主要通過(guò)如下途徑實(shí)現(xiàn)：1，通過(guò)抑制LBD介導(dǎo)的泛素修飾及泛素K48方式連接的泛素級(jí)聯(lián)反應(yīng)；2，通過(guò)對(duì)特異性降解AR的E3泛素連接酶(E3 ligase)脫磷酸化并使其失活，從而抑制其介導(dǎo)的AR降解。值得注意的是，雄激素誘導(dǎo)的A R N-C端相互作用可以顯著抑制PP1與AR相互關(guān)聯(lián)；而雄激素剝奪的條件下可以促進(jìn)PP1依賴的AR表達(dá)。此外，雄激素可以減弱PP1與AR的相互作用，而臨床上應(yīng)用的抗雄激素藥物能夠

5、逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，并且聯(lián)合PP1抑制對(duì)AR的失活有協(xié)同作用?？傊?，我們的研究揭示了由PP1介導(dǎo)的促進(jìn)AR表達(dá)的調(diào)控通路，這一通路可以補(bǔ)償雄激素缺失引起的AR表達(dá)降低，靶向PP1或PP1與AR相互作用復(fù)合體中關(guān)鍵因子，可能為C RP C治療提供新的理論依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分進(jìn)行闡述：
　　第一部分 PP1依賴的AR表達(dá)上調(diào)、轉(zhuǎn)錄激活及PP1與AR相互作用的機(jī)制
　　目的：探索雄激素剝奪條件下PP1對(duì)AR表達(dá)的影響；確定PP1與A

6、R相互作用的具體機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建質(zhì)粒HA-AR、Flag-PP1、ARE4-luciferase、pCMV-pRL-Renilla luciferase、Flag-vector、HA-vector，應(yīng)用不同前列腺癌細(xì)胞(LNCaP/C4-2)，雄激素剝奪條件下，添加或不添加 PP1特異性抑制劑：互變霉素(Tauto myc in)、雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報(bào)告

7、基因、實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)實(shí)驗(yàn)分析PP1對(duì)AR表達(dá)、A R調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞增殖的影響；N C BI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢AR氨基酸序列并進(jìn)行分析確定與 PP1相互結(jié)合的基序(K VFF)，構(gòu)建質(zhì)粒 HA-AR-KAFA、Probasin-Luciferase、Flag-AR、Flag-AR-KAFA、HA-AR-DBD、HA-AR-DBD-KAFA，利用前列

8、腺癌細(xì)胞(PC3)、人腎上皮細(xì)胞(293T)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)及非洲綠猴腎細(xì)胞(Cos1)，通過(guò)在雄激素剝奪條件下添加或不添加 DHT處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報(bào)告基因、Western blot、Microcystin-IP、Co-IP實(shí)驗(yàn)的方法,分析PP1與AR相互作用是否依賴該基序(KVFF)、KVFF突變?yōu)镵AFA對(duì)AR活性及兩者相互作用的影響；構(gòu)建質(zhì)粒Flag-Sox9、HA-AR-NTD、HA-AR-NTD-DB

9、D、HA-AR-DBD-LBD、HA-AR-LBD、His-Ub，利用293T細(xì)胞，在雄激素剝奪條件下，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Ni(nickel)-NTA-IP、Co-IP、Western blot實(shí)驗(yàn)分析PP1主要與AR哪個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用及相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的化學(xué)修飾。
　　結(jié)果：雄激素剝奪的條件下，PP1可以明顯穩(wěn)定AR表達(dá)、AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活、前列腺癌細(xì)胞的增殖，而在PP1特異性抑制后可以減弱對(duì)AR的上述影響，并且這種減弱效應(yīng)可以通過(guò)

10、DHT劑量依賴性方式緩解；在PP1與AR相互關(guān)聯(lián)中，KVFF基序起著較弱的作用：該基序突變可以影響AR的活性及其介導(dǎo)的下游基因表達(dá)，但是不影響兩者的相互作用；通過(guò)對(duì)PP1與AR的不同結(jié)構(gòu)域相互關(guān)聯(lián)的研究分析，確定PP1主要與AR中富含泛素化修飾的LBD相互作用。
　　結(jié)論：雄激素剝奪的環(huán)境中，維持AR信號(hào)通路激活需要增加PP1的表達(dá)，并且拮抗PP1可以提高前列腺癌細(xì)胞雄激素的敏感性；AR-KVFF基序在PP1與AR相互關(guān)聯(lián)中發(fā)揮的

11、作用較弱，PP1與AR相互作用可能通過(guò)其它的機(jī)制介導(dǎo)；PP1與AR相互作用主要通過(guò)AR的LBD介導(dǎo)，且該結(jié)構(gòu)域富含泛素化修飾。
　　第二部分 PP1依賴的AR穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制研究
　　目的：探索PP1通過(guò)何種機(jī)制介導(dǎo)AR穩(wěn)定表達(dá)及其具體機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建質(zhì)粒Myc-his-Ub、Myc-his-Ub-K11R、Myc-his-Ub-K48R、Myc-his-Ub-K63R、HA-Ub、Flag-AR，通過(guò)前列腺癌細(xì)胞

12、(VCaP)、293T細(xì)胞、Hela細(xì)胞，在雄激素剝奪條件下，添加或不添加蛋白酶體抑制劑(MG132)、Ta uto myc in處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、IP、Ni(nickel)-NTA-IP、Co-IP、Western blot實(shí)驗(yàn)分析PP1穩(wěn)定AR表達(dá)是否通過(guò)抑制AR的LBD介導(dǎo)的泛素降解和泛素K11、K48、K63方式連接的泛素修飾；應(yīng)用質(zhì)粒HA-AR、Flag-PP1、HA-AR、HA-AR-NTD-DBD、HA-AR-LBD、

13、HA-vector、Flag-vector，利用人宮頸癌細(xì)胞(He la)，在雄激素剝奪條件下添加或不添加蛋白酶體抑制劑(MG132)、放線菌酮(Cycloheximide，CHX)、Tautomycin處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Western blot實(shí)驗(yàn)分析PP1穩(wěn)定AR表達(dá)是否通過(guò)阻斷LBD介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體降解通路；構(gòu)建質(zhì)粒Flag-PP1-H248K、HA-AR-S650A、HA-MDM2、HA-SKP2、HA-MDM2-S16

14、6A、HA-SKP2-S72A在雄激素剝奪條件下，添加或不添加 DHT、Tautomycin處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Western blot實(shí)驗(yàn)分析PP1穩(wěn)定AR是否通過(guò)脫去E3-泛素連接酶(E3 Ligases)磷酸基團(tuán)使其失活，從而減少AR的降解。
　　結(jié)果：雄激素剝奪的條件下，PP1穩(wěn)定AR表達(dá)是通過(guò)阻斷AR的LBD介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體降解，這種機(jī)制不同于MG132抑制蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解機(jī)制：后者沒有干擾蛋白的泛素化修飾過(guò)

15、程，與PP1相關(guān)聯(lián)的單泛素、雙泛素、三泛素修飾的AR，很可能來(lái)源于夭折的多聚泛素級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的降解產(chǎn)物；不同的AR結(jié)構(gòu)域相比較，PP1不能或很少穩(wěn)定AR-NTD-DBD結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，顯示出AR的NTD端不是PP1優(yōu)先結(jié)合的底物，所以PP1阻斷泛素-蛋白酶體依賴的AR降解主要通過(guò)LBD介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)；對(duì)兩種E3-泛素連接酶的研究顯示：PP1穩(wěn)定AR表達(dá)是通過(guò)脫磷酸化與失活特異性E3-泛素連接酶，這些E3-泛素連接酶(MDM2/SKP2)可以介導(dǎo)A

16、R的泛素-蛋白酶體降解。
　　結(jié)論：雄激素剝奪的條件下，PP1穩(wěn)定AR表達(dá)，主要是通過(guò)阻斷AR的LBD介導(dǎo)的與泛素K48方式連接的泛素-蛋白酶體降解；PP1主要與AR的LBD相互關(guān)聯(lián)，PP1抑制泛素-蛋白酶體依賴的AR降解主要由AR的LBD介導(dǎo)；PP1穩(wěn)定AR表達(dá)是通過(guò)脫去特異性E3-泛素連接酶的磷酸基團(tuán)并使其失活，從而減少AR降解。
　　第三部分雄激素與抗雄激素對(duì)PP1與AR相互作用影響的研究
　　目的：探索雄激素、

17、抗雄激素激素對(duì)PP1與AR相互作用及細(xì)胞功能的影響。
　　方法：構(gòu)建質(zhì)粒 pBIND-AR-LBD、HA-AR-FxxAA，通過(guò)293T細(xì)胞，在雄激素剝奪條件下添加或不添加DHT處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Co-IP、Western blot，實(shí)驗(yàn)分析雄激素存在的環(huán)境中DHT通過(guò)何種機(jī)制干擾PP1與AR及DHT對(duì)PP1與AR融合蛋白(pBIND-AR-LBD)、AR-FxxLF突變體(AR-FxxAA)的影響；構(gòu)建質(zhì)粒 AR-W741C

18、、AR-F876L突變體，通過(guò)不同前列腺癌細(xì)胞(VCaP/ LNCaP/C4-2)、293T細(xì)胞、HeLa細(xì)胞，在雄激素剝奪條件下添加或不添加比卡魯胺(Bicalutamide)、恩雜魯胺(Enzalutamide)、米非司酮(Mifepristone)、醋酸環(huán)丙孕酮(Cyproterone acetate)、ARN509處理，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報(bào)告基因、qRT-PCR、MTT、IP、Co-IP、Western blo t實(shí)驗(yàn)分

19、析抗雄激素對(duì)PP1與AR相互作用的影響、AR介導(dǎo)的下游基因的轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：雄激素剝奪的條件下，雄激素處理會(huì)引起PP1與AR相互作用的解離，明顯地降低PP1與AR、AR-BDB-LBD結(jié)構(gòu)域的相互作用，但較小影響與AR-LBD結(jié)構(gòu)域的相互作用，雄激素處理也對(duì) PP1與 AR-FxxAA突變體相互作用影響較小；雄激素處理引起的PP1與AR相互作用的減弱，而這種變化可以通過(guò)添加比卡魯胺或恩雜魯胺處理逆轉(zhuǎn)；雄激素剝

20、奪的環(huán)境中，PP1可以顯著增加AR表達(dá)及其下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，這種影響并不被比卡魯胺或恩雜魯胺的處理所抑制，但后者可以有效地阻斷雄激素依賴的AR轉(zhuǎn)錄激活。在含有DHT的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的LNCaP細(xì)胞，恩雜魯胺可以下調(diào)AR表達(dá)、轉(zhuǎn)錄激活及細(xì)胞增值，PP1抑制連同恩雜魯胺處理對(duì)抑制AR表達(dá)及前列腺癌細(xì)胞的增值有協(xié)同效應(yīng)。
　　結(jié)論：雄激素剝奪的條件下，雄激素處理可以引起PP1與AR相互作用的解離，機(jī)制為DHT引起的AR構(gòu)象改變(N-C端