組織工程真皮移植對急性創(chuàng)面修復的實驗研究.pdf

1、背景及目的：
　　嚴重創(chuàng)傷、大面積燒傷等原因?qū)е氯珜悠つw缺損是臨床常見的病癥之一。傳統(tǒng)處理方式是創(chuàng)面清創(chuàng)后，通過換藥，待創(chuàng)面肉芽組織生長良好后再行植皮或皮瓣手術閉合創(chuàng)面。傳統(tǒng)換藥治療肉芽生長緩慢，需經(jīng)很長時間才能達到創(chuàng)面愈合，常給患者帶來極大的疼痛，并且增加醫(yī)生的工作量。然而，由于刃厚皮移植構建的皮膚常缺乏完整的真皮結構，難以完成真皮組織的重建，全厚皮、中厚皮或皮瓣移植造成的新創(chuàng)面及產(chǎn)生的瘢痕往往使患者難以接受，此外皮膚缺損面積較

2、大時，將會面臨皮源匱乏，導致供給不足的窘境。皮膚組織工程學的應用與發(fā)展為改善皮片愈合質(zhì)量及解決皮源匱乏提供了嶄新的思路和方法，而真皮替代物成為皮膚組織工程學研究的熱點。真皮替代物在皮膚重建過程中具有重要作用，其可增強創(chuàng)面愈合后皮膚彈性、柔韌性及機械耐磨性，減少瘢痕增生、控制創(chuàng)面收縮。
　　越來越多的研究發(fā)現(xiàn)組織工程皮膚需要有真皮支架的支持方能實現(xiàn)表皮功能的改善和真皮結構的重建。一方面，真皮支架作為創(chuàng)面修復的真皮模板，可引導成纖維細

3、胞和血管內(nèi)皮細胞的長入和增殖，形成新生的真皮組織，從而促進真皮結構重建;另外一方面，真皮支架可以通過表皮-真皮之間的相互作用，為表皮層提供營養(yǎng)成分，確保表皮的成活率，同時也為表皮提供良好的信號促進其成熟和分化。國外研究者已經(jīng)成功地開發(fā)出了多種真皮替代物，其中美國Integra是迄今為止較為理想的人工皮，其在深度燒傷創(chuàng)面的修復及嚴重創(chuàng)傷等領域，取得了一定的臨床效果。但這些商品化的組織工程皮膚價格昂貴，且來源有限，無法在我國臨床應用推廣。本

4、實驗選用的Lando雙層人工皮（深圳齊康醫(yī)療器械有限公司），與美國Integra具有相似的結構，上層是由符合YY0484-2004標準規(guī)定的雙組分加成型硫化硅橡膠制成硅橡膠層;下層為濕態(tài)膠原海綿層，由符合標準規(guī)定的Ⅰ型膠原（牛跟腱中提?。┡c符合國家藥品標準硫酸軟骨素（供注射用）交聯(lián)制成。是否此人工皮可快速血管化，為移植自體皮提供充足的養(yǎng)分，并為后期創(chuàng)面的修復奠定良好基礎呢？
　　本實驗將建立一種藏豬皮膚全層缺損創(chuàng)面的動物模型，用于

5、雙層人工皮的移植。我們對雙層人工皮血管化的影響進行了預實驗，結果顯示，移植后3d、7d人工皮雙層結構尚未分離，且與創(chuàng)面基底粘連不緊密。若此時強行揭去上層硅膠膜，不僅會損壞創(chuàng)基新生的血管組織，而且會使真皮支架完整性遭到破壞。移植后14d、21d人工皮存活良好，雙層結構已分離，揭去上層硅膠膜可見肉芽組織，人工皮與創(chuàng)面基底組織粘連十分緊密。在此基礎上，本實驗對雙層人工皮植入后在創(chuàng)面血管化的影響行進一步觀察，觀察其移植后14d、21d聯(lián)合自體刃

6、厚皮移植對創(chuàng)面修復的療效，并推測最佳植皮時機點，為其今后應用于臨床提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　材料和方法:
　　實驗動物及分組:24只一級藏豬（由南方醫(yī)科大學動物中心提供），體重為30-35Kg，雌雄不限。術前12h禁食，4h禁水，稱重，采用速眠新Ⅱ0.1 ml/kg肌注，3％戊巴比妥鈉1ml/kg腹腔注射聯(lián)合麻醉。動物麻醉后，將動物固定在手術臺上，于每只實驗動物背部正中線兩側(cè)分別由前向后切取3個邊長5cm深達肌肉筋膜的正

7、方形全層皮膚缺損創(chuàng)面，每側(cè)創(chuàng)面距離背部正中線至少3cm，且同側(cè)創(chuàng)面間距達5cm以上。創(chuàng)面徹底清創(chuàng)止血后，用含慶大霉素的無菌生理鹽水反復沖洗創(chuàng)面，生理鹽水紗布覆蓋備用。本實驗采用同體自身對照，右側(cè)創(chuàng)面行雙層人工皮移植術（實驗組），左側(cè)創(chuàng)面以凡士林油紗覆蓋（對照組）。實驗組將雙層人工皮硅橡膠膜面朝上，放入剛制備好的右側(cè)創(chuàng)面中，然后將其與創(chuàng)緣皮膚間斷縫合固定，并預留10cm長的縫線，打包包扎。對照組直接覆蓋凡士林紗布，其余操作同實驗組。其中8

8、只實驗動物用于移植后創(chuàng)面血管化觀察，分別于Ⅰ期移植術后第3d、7d、14d和21d隨機處死2只，行創(chuàng)面大體觀察，并取材行HE染色、Masson三色染色，免疫組化法檢測標本中CD31的表達并計數(shù)新生血管數(shù)目。另外16只實驗動物用于Ⅰ期術后14d、21d聯(lián)合自體皮片移植對創(chuàng)面修復療效的觀察，分別于14d、21dⅡ期聯(lián)合植皮術后2w、4w、8w、12w隨機處死2只動物，觀察植皮術后2w皮片成活情況及術后2w、4w、8w、12w皮片收縮及質(zhì)地情

9、況，并取材行HE染色、Masson三色染色，免疫組化法檢測標本中CD31表達并計數(shù)新生血管數(shù)目。
　　結果:
　　1.創(chuàng)面大體觀察
　　Ⅰ期移植術后，總體上實驗組創(chuàng)面較對照組干燥，感染發(fā)生率較低，肉芽組織生長較好且平整，創(chuàng)緣皮膚無明顯紅腫。實驗組術后第3d，未見肉芽組織生長;第7d肉芽組織逐漸增多，真皮支架呈淡紅色，形態(tài)保持完好，但與創(chuàng)基組織粘連不緊密;第14d人工皮雙層結構部分分離，硅膠膜易揭去，支架與創(chuàng)基組織緊密結

10、合，可見鮮紅色肉芽組織幾乎填滿整個支架，肉芽組織平整;第21d人工皮雙層結構已經(jīng)完全分離，肉芽組織尚平整，看不到真皮支架，觸之不易出血。
　　14dⅡ期聯(lián)合植皮術后2w，實驗組及對照組大部分皮片存活良好，部分創(chuàng)面皮緣可見少許壞死，實驗組皮片存活率高于對照組，但組間差異無統(tǒng)計學意義。21dⅡ期聯(lián)合植皮術后2w實驗組及對照組皮片存活較不理想，對照組皮片存活率高于實驗組，組間差異具有統(tǒng)計學意義。與實驗組14dⅡ期聯(lián)合植皮術后皮片存活率比

11、較，21dⅡ期聯(lián)合植皮術后的實驗組及對照組組間比較統(tǒng)計學均有差異。隨時間延長，實驗組14dⅡ期聯(lián)合植皮術后皮片收縮較不明顯，表面較光滑，皮片質(zhì)地較柔軟，可推移，具有較好的彈性及柔韌性;對照組14dⅡ期聯(lián)合植皮術后和實驗組及對照組21dⅡ期植皮術后的皮膚收縮明顯，部分創(chuàng)面可見明顯褶皺，表面彈性欠佳，不易推移。
　　2.組織形態(tài)學觀察
　?、衿谝浦残g后，總體上實驗組較對照組組織充血水腫及炎癥反應較輕，成纖維細胞長入較早，毛細血管

12、生長方式更接近正常皮膚，大部分平行于創(chuàng)面生長，成纖維細胞及膠原纖維排列也更規(guī)整。實驗組于術后第3d支架底部即可見成纖維細胞長入，未見細胞外基質(zhì)分泌;第7d較多成纖維細胞生長于支架孔隙中并分泌細胞外基質(zhì)成分，于交界區(qū)支架中還可見到新生的毛細血管;第14d支架內(nèi)見大量成纖維細胞、炎癥細胞浸潤，新形成的毛細血管已非常接近支架材料的表面;術后第21d支架被上層的肉芽組織及下層的肌肉組織夾被，形成三明治樣結構，支架原有的孔隙已被成纖維細胞分泌的細

13、胞外基質(zhì)所填充，炎癥細胞較前略有減少，成纖維細胞及膠原排列較規(guī)整，可見支架部分斷裂、變細等降解情況。
　?、蚱诼?lián)合植皮術后，14dⅡ期聯(lián)合植皮術后實驗組表皮分化較對照組及21dⅡ期聯(lián)合植皮術后實驗組、對照組好，可見更多釘突結構，表皮與真皮連接更緊密，膠原纖維較粗大且排列有序，未見結節(jié)狀瘢痕組織結構，膠原沉積和分布形態(tài)與正常組織更類似，但均無毛囊、汗腺、皮脂腺腺體等皮膚附件存在。實驗組14dⅡ期聯(lián)合植皮術后2w表皮已成活，可見較多釘

14、突結構，支架可見斷裂、變細等降解情況。術后4w，表皮-真皮連接處連續(xù)規(guī)則，可見分化良好的釘突結構，膠原纖維沉積明顯，支架繼續(xù)降解。術后第8w，膠原纖維排列有序，炎癥細胞、成纖維細胞及新生血管逐漸減少，支架基本完全降解。術后12w，大量表皮細胞長入真皮層內(nèi)，表皮層與真皮層緊密連接，真皮內(nèi)膠原纖維排列有序，未見結節(jié)狀瘢痕組織結構。
　　3.免疫組化觀察并計數(shù)新生血管數(shù)目
　?、衿谝浦残g后第3d，實驗組及對照組均未見CD31明顯表

15、達，第7d兩組CD31表達開始明顯升高，實驗組于術后第14d達到高峰，對照組于第21d達到最高，除實驗組第7d、21d新生血管數(shù)統(tǒng)計學無差異外（P＞0.05），兩組組內(nèi)其他時相點間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組新生血管數(shù)于術后第7d、14d數(shù)均高于對照組，術后第21d低于對照組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　14d、21dⅡ期植皮術后實驗組及對照組CD31表達陽性的新生血管數(shù)目隨時間延長而逐漸減少，

16、其中實驗組14dⅡ期移植術后減少最快，對照組21dⅡ期移植術后減少最慢，每組組內(nèi)各時相點差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與實驗組14dⅡ期植皮術后同一時相點比較，除實驗組21dⅡ期植皮術后2w組間差異無統(tǒng)計學意義外(P＞0.05)，其余組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)
　　結論:
　　1、與傳統(tǒng)油紗相比，雙層人工皮具有良好的生物相容性和生物降解性，上層硅膠膜可控制水分蒸發(fā)、防止細菌感染，下層支架早期可誘導自身的修