脂肪干細胞對創(chuàng)面修復的實驗研究.pdf

1、目的:通過分離培養(yǎng)大鼠ADSCs,經(jīng)體外擴增,建立大鼠創(chuàng)面模型探討ADSCs對組織損傷的修復作用,為其應(yīng)用于促進創(chuàng)面愈合的臨床研究提供較好的思路和理論基礎(chǔ)。
　　方法:1.ADSCs分離、培養(yǎng)、鑒定:SD大鼠數(shù)只脫臼處死,腹股溝處取得脂肪墊,剔除筋膜和血管,Hank’s液沖洗2次,用剪刀將脂肪墊剪成直徑大約為2MM的小塊,膠原酶消化法培養(yǎng) ADSCs,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)和形態(tài)變化。傳代以后,取其生長良好和生物學特性穩(wěn)定的

2、第3代ADSCs,免疫細胞化學法染色檢測CD44表達,以鑒定其抗原標記。2.BrDu標記ADSCs:取生長狀態(tài)較好的第3代ADSCs,換液后,滴加濃度為100uMol/L的BrDu工作液于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi),制成細胞懸液,CO2溫箱內(nèi)孵育48小時,移植備用。3.制備大鼠全層皮損模型:大鼠30只,3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,在其脊柱兩側(cè)制作三個1.0cMx1.0cM全層皮損創(chuàng)面。將大鼠隨機分為三組,分別為ADSCs移植

3、組、生理鹽水組、空白組。ADSCs移植組與生理鹽水組每個創(chuàng)面皮緣均勻選擇6個注射位點。ADSCs移植組每個位點皮下注射40ulADSCs細胞懸液,生理鹽水組每個位點皮下注射40ul無菌生理鹽水;空白組不做任何處理,無菌紗布覆蓋。術(shù)后3、7、14天觀察大鼠各組創(chuàng)面變化,記錄創(chuàng)面完全愈合時間。21天取創(chuàng)面組織,常規(guī)石蠟切片、包埋。HE染色法觀察各組愈合組織的形態(tài)學變化。免疫組織化學法檢測移植體內(nèi)的ADSCs存活情況,愈合組織內(nèi)CK19、Ⅲ型

4、膠原的表達變化。
　　結(jié)果:倒置顯微鏡下可見大鼠ADSCs貼壁生長,初期呈圓形或三角形,雜質(zhì)細胞較多。3-5D后,形態(tài)呈成纖維細胞樣。體外培養(yǎng)增殖速度快。傳代后,細胞形態(tài)和原代基本一致。免疫組織化學法檢測,ADSCs抗 CD44呈陽性表達。細胞移植組在早期即出現(xiàn)創(chuàng)面收縮快,創(chuàng)面的肉芽組織豐富,創(chuàng)面無滲液和周圍皮膚吻合好。并且愈合時間快于生理鹽水組和空白組。生理鹽水組和空白組創(chuàng)面愈合速度較慢,周圍有少量滲血。組織學觀察,移植組皮膚表

5、皮層增厚,真皮層膠原纖維排列整齊,成纖維細胞增多。鹽水組和空白組變化不明顯。免疫組織化學法檢測,移植組皮膚表皮層CK19表達增多(P<0.05),鹽水組和空白組表達水平無明顯差異(P>0.05);移植組皮膚真皮層Ⅲ型膠原表達增多(P<0.05),生理鹽水組和空白組Ⅲ型膠原表達水平無明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:1.大鼠ADSCs獲取容易,易于體外培養(yǎng)、分離。具有間充質(zhì)干細胞的表面標志。2.體內(nèi)移植 ADSCs后,實驗動物未