組織工程神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、生物學(xué)特性及向類(lèi)雪旺細(xì)胞誘導(dǎo)分化。
　　 目的：掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并探討其生物學(xué)特性及向類(lèi)雪旺細(xì)胞分化的條件。
　　 方法：無(wú)菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨和胸骨，并用吸取D-Hank’s液的注射器沖出骨髓細(xì)胞，置于含10％FBS、100U/ml雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進(jìn)行純化。待細(xì)胞達(dá)95％

2、融合時(shí)，用0.125％的胰酶-0.02％的EDTA消化2-3min后進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀(guān)察原代及傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)。用MTT法測(cè)定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，從而進(jìn)一步了解其生長(zhǎng)特性。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按順序分別加入β-巰基乙醇、全反式視黃酸、Forskolin、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA向類(lèi)雪旺細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，在倒置顯微鏡下觀(guān)察生長(zhǎng)情況及誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)變化，S-100、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染

3、色并計(jì)算其陽(yáng)性率，Western-blot法檢測(cè)S-100、GFAP蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)顯示原代細(xì)胞1-2天開(kāi)始有少量細(xì)胞貼壁，形狀不規(guī)則，呈梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，7-9天左右細(xì)胞可長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底，達(dá)95％以上融合，呈漩渦狀，輻射狀或魚(yú)群樣排列。傳代后2h后部分細(xì)胞即開(kāi)始貼壁，24h內(nèi)即可完全貼壁，6-7天可鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底。傳代10代以上，各代之間細(xì)胞生長(zhǎng)均一，穩(wěn)定。P2、P4、P6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本相同，分為潛伏期（第

4、1-2天）、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（第3-5天）和平臺(tái)期（第6-7天），且?guī)状?xì)胞間生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定。依次加入誘導(dǎo)劑后部分細(xì)胞向雪旺細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，胞體呈橢圓形，有2-3個(gè)纖細(xì)的細(xì)胞突起，成縱形柵欄狀排列，免疫細(xì)胞化學(xué)染色S-100和GFAP表達(dá)陽(yáng)性率分別為71.34％和68.32％，Western-blot檢測(cè)有S-100，GFAP表達(dá)，未誘導(dǎo)細(xì)胞則不表達(dá)。
　　 結(jié)論：1應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離法成功建立了一種體外簡(jiǎn)單、快速的分離、純化大

5、鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并使其在體外迅速得到了增殖，而且性狀穩(wěn)定。2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞。
　　 二、羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及生物相容性的研究
　　 目的：通過(guò)去污劑和酶消化法進(jìn)行羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備，并觀(guān)察其作為組織工程支架材料的生物相容性。
　　 方法：取新鮮人羊膜沖洗后以1％tritonX-100溶液振蕩24 h，0.25％胰蛋白酶37℃振蕩4 h，充分漂洗，干燥后環(huán)氧乙烷消

6、毒，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和掃描電鏡檢測(cè)，皮下埋置實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其組織相容性。四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液對(duì)類(lèi)雪旺細(xì)胞毒性。取培養(yǎng)的類(lèi)雪旺細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)于羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)上，倒置顯微鏡下觀(guān)察生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行蘇木精.伊紅檢測(cè)。
　　 結(jié)果：制備的羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)為白色菲薄、半透明的膜狀物，柔韌性好，經(jīng)蘇木精-伊紅和掃描電鏡檢測(cè)無(wú)細(xì)胞殘留。皮下埋置實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其組織相容性好。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液對(duì)類(lèi)雪旺細(xì)胞毒性評(píng)分為1級(jí)，復(fù)合培養(yǎng)后可見(jiàn)

7、羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)表面細(xì)胞黏附生長(zhǎng)良好，細(xì)胞伸展，形態(tài)與正常培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)差異。
　　 結(jié)論：經(jīng)去污劑和酶消化法制備的羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)生物相容性良好，是一種理想的組織工程支架材料。
　　 三、類(lèi)雪旺細(xì)胞復(fù)合羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討應(yīng)用類(lèi)雪旺細(xì)胞及羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)效果，為臨床研究提供資料。
　　 方法：以類(lèi)雪旺細(xì)胞為種子細(xì)胞，羊膜脫細(xì)胞基

8、質(zhì)為支架材料，體外復(fù)合培養(yǎng)后構(gòu)建組織工程化神經(jīng)來(lái)修復(fù)大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損。術(shù)后12周，通過(guò)大體觀(guān)察、電生理檢測(cè)、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、逆行示蹤及圖像分析等多方面分析評(píng)價(jià)修復(fù)效果。
　　 結(jié)果：術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組患肢潰瘍基本愈合，移植段與近、遠(yuǎn)坐骨神經(jīng)直徑相當(dāng)。組織學(xué)檢查示含有大量的有髓神經(jīng)纖維，且髓鞘較厚。透射電鏡見(jiàn)再生神經(jīng)纖維呈較成熟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，髓鞘板層清晰。電生理功能檢測(cè)、逆行示蹤檢測(cè)被HRP標(biāo)記的神經(jīng)元及圖像分析與自體神經(jīng)

9、移植組相比無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：類(lèi)雪旺細(xì)胞復(fù)合羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建的組織工程化人工神經(jīng)可以成功修復(fù)大鼠周?chē)窠?jīng)缺損，其效果接近于自體神經(jīng)移植。
　　 四、創(chuàng)傷性腦組織勻漿對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響
　　 目的：觀(guān)察創(chuàng)傷后24 h和正常腦組織勻漿誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的差別。
　　 方法：采用Gruncr改良法制作中度腦損傷大鼠模型，取傷后24 h和正常大鼠腦組織勻

10、漿，對(duì)體外培養(yǎng)的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的表達(dá)，比較創(chuàng)傷后和正常腦組織勻漿兩組誘導(dǎo)率差別。
　　 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)創(chuàng)傷性腦組織勻漿培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞的胞體變大，36 h后部分細(xì)胞分化，回縮成圓形或梭形，48 h后部分細(xì)胞可見(jiàn)兩個(gè)或多個(gè)突起伸出，類(lèi)似神經(jīng)元。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)顯示，創(chuàng)傷性腦組織勻漿培養(yǎng)基誘導(dǎo)組神經(jīng)元特異性