抗生素相關(guān)性腹瀉模型的構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　人類(lèi)胃腸道寄居著大量的微生物，重量可達(dá)1-2kg，數(shù)量多達(dá)1014，為人體細(xì)胞的10倍，種類(lèi)高達(dá)1000余種，構(gòu)成人體腸道內(nèi)復(fù)雜而龐大的微生態(tài)系統(tǒng)。盡管腸道菌群種類(lèi)繁多，但主要以四大菌門(mén)為主:擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)。種類(lèi)不同的腸道菌群相互拮抗、相互協(xié)同，在質(zhì)和量上形成一種動(dòng)態(tài)平衡，組成人體腸粘膜屏障中的生物屏障部分，在人體中主要發(fā)揮著重要作用:拮抗致病菌，維護(hù)黏膜屏障;免疫調(diào)節(jié)（包括全身和局部免疫）;降

2、解食物殘?jiān)?，合成營(yíng)養(yǎng)成分等。
　　一旦腸道微生物群的組成、分布和數(shù)量發(fā)生改變超出自身調(diào)節(jié)能力，即出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡，可引起腸道乃至全身的一系列病理病生改變，導(dǎo)致諸多疾病的發(fā)生，如抗生素相關(guān)性腸炎、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、腸癌甚至肥胖、糖尿病、冠心病等。
　　抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)是指應(yīng)用抗生素后導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)而引起的最常見(jiàn)的醫(yī)源性腹瀉，

3、是很多種抗生素常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一。輕度的AAD主要表現(xiàn)在大便頻次及性狀上的改變，重度的AAD主要表現(xiàn)為致病菌大量繁殖，引起腸黏膜損傷和炎癥，發(fā)生炎癥性腹瀉。其中艱難梭菌感染性腹瀉(CDAD)占了AAD的10％-25％。其他致病菌還有沙門(mén)菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、念珠菌、金葡菌等?？股叵嚓P(guān)性腹瀉的危險(xiǎn)因素很多，宿主因素方面，包括年齡＞65歲、女性、免疫力降低、合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病等;抗生素因素方面，幾乎所有的抗生素都會(huì)引起抗生素相關(guān)性

4、腹瀉，但對(duì)于腸道微生態(tài)的影響及腹瀉出現(xiàn)的概率主要與其抗生素的抗菌譜、藥代動(dòng)力學(xué)、用藥途徑和到達(dá)腸腔中的濃度有關(guān)。廣譜抗生素特別是針對(duì)腸桿菌及厭氧菌和那些在腸腔殘留濃度較高的抗生素（抗生素較少吸收或不完全吸收或經(jīng)膽汁分泌）較易引起腸道細(xì)菌的改變，廣譜青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)及克林霉素等引起的腹瀉發(fā)生率較高。
　　現(xiàn)有研究認(rèn)為AAD的發(fā)病機(jī)理有:抗生素抑制了正常優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)，臨床可以表現(xiàn)為無(wú)癥狀，或者停用藥物后正常菌群會(huì)在短期恢復(fù)，對(duì)于

5、部分患者正常菌群出現(xiàn)失衡后會(huì)導(dǎo)致機(jī)會(huì)致病菌（如艱難梭菌等）的過(guò)度生長(zhǎng)，從而出現(xiàn)腹瀉甚至偽膜性腸炎。此外，抗生素造成的菌群失調(diào)還破壞了微生態(tài)的代謝功能，導(dǎo)致碳水化合物吸收減少?gòu)亩霈F(xiàn)滲透性腹瀉，或減少短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，從而減少結(jié)腸對(duì)于液體的吸收，最終出現(xiàn)分泌性腹瀉。另一方面，抗生素本身所致的變態(tài)反應(yīng)、毒性作用可直接引起腸粘膜損害和腸上皮纖毛萎縮，從而導(dǎo)致吸收障礙性腹瀉。最后，某些抗生素（如大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)）是胃動(dòng)素受體的激動(dòng)劑，而胃動(dòng)素為胃腸肽

6、，可以刺激胃竇和十二指腸收縮，引起腸蠕動(dòng)改變，導(dǎo)致腹瀉、腸痙攣和嘔吐。
　　目前微生態(tài)制劑，包括益生菌、益生元和合生元已作為一種新型手段廣泛應(yīng)用于抗生素相關(guān)性腹瀉的治療，其根本目的在于恢復(fù)和穩(wěn)定原來(lái)的微生態(tài)系統(tǒng)，但其具體的有效性及機(jī)理機(jī)制研究仍較為匱乏，制備抗生素誘導(dǎo)的腹瀉模型有利于檢驗(yàn)微生態(tài)制劑對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉的治療作用及機(jī)理機(jī)制研究，此外還有利于微生態(tài)制劑的推廣使用?？股卣T導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)腹瀉模型的建立方法有很多，大致可以

7、分為2大類(lèi):1.單用抗生素類(lèi)型使用抗生素各異，包括有頭孢曲松鈉、鹽酸林可霉素或克林霉素、氨芐青霉素、多粘菌素等，甚至兩聯(lián)或三聯(lián)用藥;劑量也各異，采取臨床1自20倍劑量不等進(jìn)行灌胃，給藥天數(shù)在1自10天不等，如李景等以氨芐青霉素灌胃小鼠，每次灌胃0.5ml(0.45g/ml)，2次/d，連續(xù)5d造成腸道菌群失調(diào)腹瀉模型。2.抗生素+致病菌類(lèi)型主要是在使用抗生素造成菌群失調(diào)的情況下，人為地給予臨床腹瀉病人常見(jiàn)致病菌，造成菌群失調(diào)性腹瀉模型，

8、如熊德鑫等在用氨芐青霉素鈉(15～40g/kg)8小時(shí)后喂服攻擊菌（107～109CFU/ml，0.2ml/次）痢疾桿菌、大腸桿菌、傷寒沙門(mén)菌造成腹瀉模型。方法雖然很多，但是仍存在許多不足:相關(guān)文獻(xiàn)仍沒(méi)有統(tǒng)一的判斷抗生素相關(guān)性腹瀉的動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)，大多文獻(xiàn)只是根據(jù)菌群失調(diào)概念進(jìn)行判定，對(duì)于腹瀉癥狀是否出現(xiàn)有的文獻(xiàn)并沒(méi)有提及，有的文獻(xiàn)只是略提腹瀉率，但沒(méi)有具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn);此外，造模用的抗生素及其劑量、時(shí)間等仍未有統(tǒng)一明確的標(biāo)準(zhǔn)。
　　本

9、研究中，我們?cè)噲D根據(jù)臨床腹瀉及菌群失調(diào)定義制定抗生素相關(guān)性腹瀉的標(biāo)準(zhǔn)，用不同劑量的克林霉素或三聯(lián)抗生素制作出穩(wěn)定的、重復(fù)性較好的抗生素相關(guān)性腹瀉模型，此外，還通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)整個(gè)造模過(guò)程大鼠常見(jiàn)菌群的變化，確定造模用藥時(shí)間、劑量和模型的自然病程。
　　方法：
　　1.抗生素相關(guān)性腹瀉模型給藥方法及時(shí)間:分別用生理鹽水(A)、25mg/ml克林霉素(B)、50mg/ml克林霉素(C)、75mg/ml克林

10、霉素(D)、(25+28+14mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(E)、(50+56+28mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(F)、(75+84+42mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(G)溶液各2ml給予對(duì)照組(A)和克林霉素低(B)、中(C)、高(D)劑量組及三聯(lián)抗生素低(E)、中(F)、高(G)劑量組的SD大鼠，共灌胃7天，之后進(jìn)行為期8天的病程觀察。
　　2.每天對(duì)大鼠體重、飲食、飲水、糞便形態(tài)等進(jìn)行記錄，從第

11、7天至第14天對(duì)固定時(shí)間收集的大鼠2小時(shí)糞便總重進(jìn)行稱(chēng)重，并將糞便烤干后計(jì)算糞便的干濕重比，用以作為評(píng)價(jià)大鼠腹瀉癥狀的指標(biāo)。
　　3.分別于實(shí)驗(yàn)的第1、4、8、11、14天無(wú)菌采集各組大鼠糞便，用細(xì)菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法對(duì)其進(jìn)行常見(jiàn)菌群的檢測(cè)，并對(duì)這兩種方法檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。
　　4.在第11天和第15天各組分別各處死一半的大鼠，采取回腸、盲腸和結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，并收集盲腸糞便進(jìn)行盲腸細(xì)菌定植情況分析。<

12、br>　　結(jié)果：
　　1、體重、飲食、飲水結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，各造模組體重變化、飲食量無(wú)明顯差異;各克林霉素組飲水量呈升高趨勢(shì)，但無(wú)劑量相關(guān)性，而三聯(lián)抗生素組飲水量呈升高趨勢(shì)，且與劑量呈正比。
　　2、腹瀉癥狀評(píng)定
　　糞便形態(tài)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，各造模組（除D組外）給藥第2天開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的軟便、稀便，癥狀在第6、7天最明顯，持續(xù)至第14天，第15天各組癥狀開(kāi)始有所恢復(fù)。不同組間比較發(fā)現(xiàn)，B、E、F、G組的

13、癥狀更為明顯而穩(wěn)定。
　　糞便干濕重比值顯示:與對(duì)照組相比，各造模組（除D組外）在第7至第14天糞便的干濕重比值明顯下降，且較平穩(wěn)，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;此外，克林霉素組劑量與糞便干濕重比值下降程度具有一定負(fù)相關(guān)性，三聯(lián)抗生素組無(wú)劑量相關(guān)性。
　　2小時(shí)糞便總重顯示:雌、雄大鼠糞便總重差異較大;與對(duì)照組相比，B、C、F組雌、雄2小時(shí)糞便總重均明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，D組雌、雄和G組雄性2小時(shí)糞便均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，E組不同天

14、數(shù)波動(dòng)范圍較大，有的無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.不同天數(shù)菌群變化
　　細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示:對(duì)照組在不同天數(shù)菌群基本比較穩(wěn)定。而各造模組從給藥后出現(xiàn)乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌明顯下降，大腸桿菌、酵母菌明顯增加，腸球菌、金葡菌和厭氧球菌先被抑制，后在第8天明顯增加，以上在第14天未能恢復(fù)正常;而擬桿菌先被抑制，在第14天得到不同程度的恢復(fù)。此外，克林霉素組和三聯(lián)抗生素組菌群變化較相似，不同劑量之間也未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　熒

15、光定量PCR結(jié)果顯示對(duì)照組在不同天數(shù)菌群也比較穩(wěn)定。C組總的細(xì)菌無(wú)明顯變化，雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯下降，大腸桿菌明顯增加，腸球菌、擬桿菌先減少，后在第8天恢復(fù)甚至明顯增加，持續(xù)至第11天。F組總的細(xì)菌在用藥第四天出現(xiàn)明顯下降，相應(yīng)的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌均明顯下降，在第8天至11天，雙歧桿菌，乳酸桿菌仍處于較低水平，而擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌明顯增加。
　　4.熒光定量PCR和細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比顯示:用qPCR

16、檢測(cè)出擬桿菌數(shù)量高于細(xì)菌培養(yǎng)方法，而檢測(cè)出大腸桿菌數(shù)量低于細(xì)菌培養(yǎng)方法，乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌兩種方法檢出率比較一致。
　　5.盲腸細(xì)菌定植結(jié)果顯示:第11天，與對(duì)照組相比，C組和F組盲腸定植細(xì)菌中總的細(xì)菌和擬桿菌無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，大腸桿菌和腸球菌明顯增加，成為優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸桿菌和雙歧桿菌明顯下降。第15天，與對(duì)照組相比，C組和F組總的細(xì)菌無(wú)明顯差異，雙歧桿菌、乳酸桿菌得到一定恢復(fù)，但是優(yōu)勢(shì)菌群仍為擬桿菌、大腸桿菌和腸球菌。<

17、br>　　6.不同部位組織病理學(xué)結(jié)果顯示:在第11天和第15天，與對(duì)照組相比，大鼠回腸、結(jié)腸HE染色鏡下觀察無(wú)明顯炎癥表現(xiàn)，而在盲腸部位，各造模組均出現(xiàn)輕中度炎癥表現(xiàn)，其中B、D、F組炎癥程度相對(duì)其他造模組更嚴(yán)重。
　　結(jié)論：
　　1.不同劑量組的克林霉素和三聯(lián)抗生素均能誘導(dǎo)菌群失調(diào)，但結(jié)合腹瀉指標(biāo)，認(rèn)為B、F組作為抗生素相關(guān)性腹瀉模型更優(yōu)。
　　2.抗生素的劑量與誘導(dǎo)的腹瀉癥狀及菌群失調(diào)及炎癥嚴(yán)重程度無(wú)明顯劑量相關(guān)性