ADSCs移植對(duì)老年性骨質(zhì)疏松鼠影響的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)為骨的全身性代謝疾病之一，脂肪組織中分離獲取的脂肪源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種。通過(guò)增加機(jī)體內(nèi)未分化的ADSCs，促進(jìn)成骨分化，從而加強(qiáng)骨重建，可能會(huì)在骨質(zhì)疏松的治療領(lǐng)域起到相應(yīng)的作用。
　　為了探討異體脂肪源干細(xì)胞移植對(duì)老年性骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)微型計(jì)算機(jī)斷層成像(microCT)、血清學(xué)等檢測(cè)方法來(lái)觀

2、測(cè)脂肪源干細(xì)胞移植對(duì)自發(fā)老年性骨質(zhì)疏松模型小鼠(僅有的一種能證明增齡性骨脆性骨折的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SAMP6)體內(nèi)自由基、血清睪酮、骨鈣素、鈣、磷、堿性磷酸酶等代謝，以及骨密度、骨生物力學(xué)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)等方面的影響。
　　目的：
　　1、體外分離培養(yǎng)取自SD大鼠腹股溝皮下墊的ADSCs，并對(duì)其進(jìn)行多向分化潛能和表面標(biāo)志的鑒定;
　　2、觀測(cè)脂肪源干細(xì)胞移植對(duì)自發(fā)老化性骨質(zhì)疏松小鼠SAMP6的血清睪酮(T)、骨鈣素(BGP)

3、、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等表達(dá)的影響，闡述脂肪源干細(xì)胞移植抗代謝性衰老的血清學(xué)意義;
　　3、通過(guò)檢測(cè)小鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶，觀測(cè)ADSCs移植對(duì)自發(fā)老化性骨質(zhì)疏松小鼠SAMP6體內(nèi)的鈣磷代謝及骨形成的影響;
　　4、通過(guò)microCT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的骨密度和骨微結(jié)構(gòu)，觀測(cè)ADSCs移植對(duì)自發(fā)老化性骨質(zhì)疏松小鼠SAMP6骨質(zhì)量和骨組織微環(huán)境的影響;
　　5、通過(guò)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢

4、測(cè)，觀察移植ADSCs對(duì)自發(fā)老化性骨質(zhì)疏松小鼠SAMP6骨強(qiáng)度及骨剛度的影響;
　　6、通過(guò)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀測(cè)，評(píng)估移植ADSCs對(duì)自發(fā)老化性骨質(zhì)疏松小鼠SAMP6骨內(nèi)微環(huán)境的影響;
　　7、為干細(xì)胞可以治療代謝性、退行性和衰老性疾病提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、于2月齡SD大鼠腹股溝皮下脂肪墊取材，以酶消化法來(lái)體外分離培養(yǎng)脂肪源干細(xì)胞。對(duì)5代脂肪源干細(xì)胞采用形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)鑒定（表面抗原CD29、

5、CD90、CD11b、CD49d、CD106和CD45）。第5代ADSCs通過(guò)采用定量PCR觀察ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)基因Oct4、Dazl、Nobox、Piwil，進(jìn)而判斷ADSCs是否具有向生殖細(xì)胞分化的潛能;并分別經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化和成脂肪誘導(dǎo)分化后，進(jìn)行相應(yīng)的茜素紅和油紅O染色，進(jìn)而判斷所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為具有多向分化潛能的脂肪源干細(xì)胞。
　　2、20只6月齡雄性自發(fā)老化性骨質(zhì)疏松小鼠SAMP6、10只6

6、月齡正常同源對(duì)照小鼠SAMR1，隨機(jī)分為SAMR1空白對(duì)照組（A組）、SAMP6骨質(zhì)疏松模型對(duì)照組（B組）、ADSCs移植治療組（C組），每組10只。
　　3、ADSCs移植干預(yù)治療骨質(zhì)疏松模型SAMP6:收集原代培養(yǎng)傳至第3代的脂肪源干細(xì)胞，無(wú)菌生理鹽水重懸，制成濃度3×106cells/mL細(xì)胞懸液。通過(guò)尾靜脈向每只治療組SAMP6注射脂肪源干細(xì)胞3×106個(gè)細(xì)胞，而每只模型對(duì)照組SAMP6、空白對(duì)照組注射1mL生理鹽水，4周

7、后檢測(cè)。
　　4、實(shí)驗(yàn)小鼠采用水合氯醛麻醉（微型計(jì)算機(jī)斷層成像檢測(cè)后），心臟取血，促凝管接取后在室溫下放置8h，離心15min，3000r/min，取上清制備血清，分裝后-70℃保存。血清睪酮(T)和骨鈣素(BGP)水平測(cè)定用放免法;用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硝酸還原酶法測(cè)定血清NO，用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定血清丙二醛(MDA)含量。用全自動(dòng)生化分析儀分別利用偶氮砷Ⅲ法、磷鉬酸比色法和速率法測(cè)定血

8、清中鈣、磷及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量。
　　5、實(shí)驗(yàn)小鼠采用水合氯醛麻醉，利用microCT測(cè)定腰椎、右側(cè)股骨和右側(cè)脛骨的三維骨形態(tài)計(jì)量參數(shù)。MicroCT掃描完成后，于距離生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0mm選取層厚3.0mm骨組織來(lái)對(duì)松質(zhì)骨的感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重建。
　　結(jié)果：
　　1、光學(xué)顯微鏡觀察顯示，原代培養(yǎng)的ADSCs在24小時(shí)后大部分可貼壁，細(xì)胞呈梭形、多邊形、圓形等。細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)

9、良好，6天后按照1∶3的比例傳代，之后每3天傳代一次。傳至第5代的細(xì)胞形態(tài)均一，多呈紡錘形或多角形。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD90、CD29呈強(qiáng)陽(yáng)性，CD106呈弱陽(yáng)性，而CD49d、CD45和CD11b呈陰性。在ADSCs成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，油紅O染色可顯示細(xì)胞漿內(nèi)橙紅色的特異性脂滴;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，茜素紅染色可顯示呈粉紅色的特異性的礦化結(jié)節(jié);定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后ADSCs能表達(dá)生殖相關(guān)Oct4、Dazl、Nobox

10、、Piwil四個(gè)基因，說(shuō)明體外培養(yǎng)的ADSCs可以向成脂、成骨、成生殖方向誘導(dǎo)分化。
　　2、SAMR1空白對(duì)照組、SAMP6模型對(duì)照組、ADSCs移植治療組之間的血清睪酮含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2816.581，P＜0.001），與SAMR1空白對(duì)照組比較，SAMP6模型對(duì)照組小鼠血清睪酮水平有所降低(P＜0.001)，提示老年骨質(zhì)疏松小鼠模型已復(fù)制成功;與SAMP6模型對(duì)照組比較，4周治療后，ADSCs治療組小鼠血清睪酮

11、有所提高(P＜0.001)。
　　方差分析結(jié)果顯示三組小鼠血清骨鈣素(BGP)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.017，P＜0.001)，SAMP6模型對(duì)照組小鼠血清BGP水平明顯高于SAMR1空白對(duì)照組，差異具顯著性(P＜0.001);經(jīng)4周治療后，ADSCs移植治療組血清BGP水平較SAMP6模型組有所下降（P＜0.001）。
　　同時(shí)各組整體比較血清Ca(F=105.029，P＜0.001)、P(F=30.858，

12、P＜0.001)及ALP(F=9.446，P＜0.05)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAMP6模型對(duì)照組與SAMR1空白對(duì)照組比較，血清Ca和ALP(P＜0.05)水平明顯降低，血清P水平(P＜0.05)則明顯上升。與SAMP6模型對(duì)照組比較，ADSCs治療組可顯著提高血清Ca和ALP水平，但均低于空白對(duì)照組（P＜0.05）;ADSCs治療組血清P水平則明顯低于模型組（P＜0.01）。
　　并且方差分析結(jié)果顯示三組的血清SOD(F=235.0

13、44，P＜0.001)、血清NO水平(F=286.880，P＜0.001)、血清MDA水平（F=54.327，P＜0.001）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAMP6模型對(duì)照組與SAMR1空白對(duì)照組比較，血清MDA水平顯著性升高（P＜0.001），而血清SOD(P＜0.001)、血清NO(P＜0.001)均顯著性降低，提示骨質(zhì)疏松小鼠模型復(fù)制成功。相比SAMP6模型對(duì)照組，細(xì)胞移植治療后骨質(zhì)疏松小鼠SOD活性（P＜0.001）、血清NO水平(P

14、＜0.001)有所提高，降低MDA水平(P＜0.001)。
　　3、SAMR1空白對(duì)照組、SAMP6模型對(duì)照組、ADSCs移植治療組之間的骨強(qiáng)度(F=18.013，P＜0.001)、骨剛度（F=35.133，P＜0.001）、腰椎骨密度（F=38.220，P＜0.001）、股骨骨密度(F=70.312，P＜0.001)、骨小梁數(shù)量（F=131.291，P＜0.001）、相對(duì)體積(F=85.962，P＜0.001)和厚度(F=13.

15、159，P＜0.001)、骨小梁分離度(F=69.714，P＜0.001)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)(F=600.711，P＜0.001)，各向異性度(DOA)（F=36.804，P＜0.001）、單位骨小梁的破骨細(xì)胞數(shù)(F=456.168，P＜0.001)顯示比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、腹股溝皮下脂肪組織分離、培養(yǎng)增殖的脂肪源干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、多角形，可形成細(xì)胞集落。在ADSCs成脂方向誘導(dǎo)分化14d后，油紅

16、O染色細(xì)胞胞漿內(nèi)可顯示特異性的脂滴;成骨方向誘導(dǎo)分化21d后，茜素紅染色可顯示呈粉紅色的特異性礦化結(jié)節(jié);定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后ADSCs能表達(dá)生殖相關(guān)Dazl、Oct4、Nobox、Piwil四個(gè)基因;該細(xì)胞經(jīng)定向誘導(dǎo)后體外可以向成生殖、成骨、成脂肪分化，與間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的功能一致。細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ADSCs的表面標(biāo)志物CD90、CD29呈強(qiáng)陽(yáng)性，CD106呈弱陽(yáng)性，而CD49d、CD45和CD

17、11b呈陰性。
　　2、通過(guò)移植脂肪源干細(xì)胞可顯著升高骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)血清睪酮含量、骨鈣素水平，可有效改善體內(nèi)鈣、磷代謝，為臨床上骨質(zhì)疏松癥的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法;
　　3、尾靜脈移植脂肪源干細(xì)胞后，可顯著升高骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)血清SOD含量和NO水平，而且有效降低血清丙二醛(MDA)含量。
　　4、尾靜脈移植脂肪源干細(xì)胞后，Micro CT檢測(cè)結(jié)合骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析（印證可互相補(bǔ)充且高度相關(guān)），可見(jiàn)