茉莉酸甲酯對(duì)羅漢果皂苷生物合成途徑的影響及羅漢果中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的初篩.pdf

1、葫蘆烷型三萜皂苷即羅漢果皂苷是羅漢果（Siraitia grosvenorii）果實(shí)中的主要有效成分。前期本實(shí)驗(yàn)室克隆了直接催化皂苷骨架合成的關(guān)鍵酶基因SgCS的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)了能與bHLH蛋白結(jié)合的E-box，提示羅漢果中可能存在能夠調(diào)控SgCS基因表達(dá)從而影響皂苷生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)報(bào)道，茉莉酸甲酯(methyljasmonate，MeJA)能夠促進(jìn)植物中三萜類化合物的積累。為了促進(jìn)羅漢果皂苷含量的提高并研究皂苷合成可能的分

2、子機(jī)制，本研究通過對(duì)羅漢果幼果施加MeJA，觀察其對(duì)皂苷含量及合成相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響。同時(shí)，通過羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，初步篩選可能調(diào)控皂苷合成及能與合成酶基因SgCS啟動(dòng)子結(jié)合的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的羅漢果幼果施加不同濃度的MeJA，檢測(cè)其對(duì)羅漢果皂苷Ⅱ E及中間產(chǎn)物角鯊烯和葫蘆二烯醇的含量及其對(duì)13個(gè)相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，在授粉后30天施加500μmol/L

3、 MeJA能誘導(dǎo)代謝產(chǎn)物含量的積累。其中，皂苷Ⅱ E的質(zhì)量百分含量(％)在48 h較對(duì)照組相比增長(zhǎng)了15％，角鯊烯和葫蘆二烯醇的含量較對(duì)照組增加了19％和22％。熒光定量PCR結(jié)果顯示在上述MeJA的處理?xiàng)l件下，11個(gè)基因的表達(dá)量均有不同程度的提高，且這些基因?qū)eJA的響應(yīng)與施加MeJA的濃度及時(shí)間有關(guān)。
　　2、對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建的3、50和70 DAF羅漢果轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)已注釋家族的轉(zhuǎn)錄因子Unigene共468個(gè)

4、，其中數(shù)目最多的轉(zhuǎn)錄因子家族為bHLH、WRKY和MYB類轉(zhuǎn)錄因子，分別為79、57、50個(gè)。以70 DAF/3 DAF、50 DAF/3DAF和70 DAF/50 DAF組中任意一組基因有表達(dá)差異為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)了共119個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Unigene。此外，以經(jīng)MeJA誘導(dǎo)后皂苷合成途徑被上調(diào)的羅漢果為材料，利用熒光定量PCR檢測(cè)在50 DAF/3 DAF和70 DAF/3 DAF組中具有顯著表達(dá)差異的6個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子Unigene的表達(dá)

5、量，結(jié)果顯示有4個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子Unigene的表達(dá)量被上調(diào)，其中bHLH093和bHLH096的表達(dá)量增加約10倍左右。
　　3、建立羅漢果果實(shí)cDNA文庫(kù)，以SgCS基因啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)E-box基序串聯(lián)形成的基因序列為誘餌，利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)篩選能與SgCS基因啟動(dòng)子結(jié)合的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，得到52個(gè)陽性克隆，但測(cè)序結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子。
　　本研究表明，外源施加MeJA能夠促進(jìn)羅漢果中皂苷的積累。此外，羅漢果c