小膠質(zhì)細胞TRIF信號在視神經(jīng)損傷再生中的作用及機制.pdf

1、一直以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous Sytem，CNS)損傷和再生研究是神經(jīng)科學領域的研究熱點，不僅具有基礎研究價值而且具有重要的臨床應用價值。隨著交通工具不斷增多、人口不斷增加，外傷引起的CNS損傷呈逐年上升趨勢。由于目前CNS損傷的特性，其再生難度巨大，在臨床上還未有顯著療效和突破，是危害人類健康和家庭幸福的主要疾病之一?；A研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)在和外在因素對視神經(jīng)(Optic Nerve，ON)的再生具有顯著的影響，作

2、為研究CNS損傷的模型，視神經(jīng)的再生已成為可能，并為CNS的再生提供借鑒和基礎。因此，近年來視神經(jīng)常被用于研究CNS損傷機制，以視神經(jīng)損傷為模型探討CNS軸突再生機制以及開發(fā)出阻抑或減緩病變發(fā)展的藥物近年成為神經(jīng)科學領域關注的熱點。
　　 天然免疫系統(tǒng)的模式識別作用已不僅僅限于對外來病原體的免疫反應。越來越多的研究表明，天然免疫系統(tǒng)與CNS的發(fā)育和再生關系密切。小膠質(zhì)細胞是CNS中表達天然免疫受體TLR的重要細胞之一，在CNS中

3、介導天然免疫系統(tǒng)和神經(jīng)元相互作用，具有免疫監(jiān)視、炎癥調(diào)理和識別吞噬等功能。小膠質(zhì)細胞TLR過度激活可加重炎癥反應與神經(jīng)元損傷。作為TLR3和TLR4下游重要接頭分子，TRIF近年來在天然免疫領域的作用逐漸被揭示。研究結(jié)果提示，小膠質(zhì)細胞TLR3及TLR4過度激活可釋放大量炎癥因子、抑制神經(jīng)元軸突再生、加重神經(jīng)元損傷。以往研究發(fā)現(xiàn)，TRIF介導IFN-β合成和釋放，能夠?qū)谷肭諧NS的病毒，保護神經(jīng)元免受感染，起重要的免疫防御作用。然而T

4、RIF在神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)源性炎癥和免疫調(diào)理中的作用仍未闡明。
　　 本研究中，我們應用免疫熒光化學，分子生物學等方法觀察TRIF定位及小膠質(zhì)細胞在視網(wǎng)膜中的病理變化；通過腦立體定位注射，將熒光金逆行標記RGC，觀察TRIF敲除情況下RGC存活情況；同時利用動物在體電生理方法測試視覺通路電生理，并利用離體細胞模型觀察小膠質(zhì)細胞和RGC的相互作用，其主要結(jié)果如下：
　　 主要結(jié)果
　　 1.利用神經(jīng)逆行標記方法發(fā)現(xiàn)，視神

5、經(jīng)鉗夾傷手術后，標記熒光金的RGC在術后7d、14d和21d不斷減少，fVEP結(jié)果顯示視覺誘發(fā)電位在7d、14d和21d基本無顯著波幅，而假手術組眼的fVEP均正常，與手術組差異顯著(P<0.001)。
　　 2.Western blot(WB)結(jié)果顯示，伴隨損傷時程增加，TRIF呈顯著增高趨勢。免疫熒光化學結(jié)果顯示，TRIF定位于視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞，與小膠質(zhì)細胞特異性標志物Ibal共標，而不與神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞特異性標志物共標

6、。
　　 3.與WT小鼠相比，TRIF敲除鼠視神經(jīng)鉗夾傷手術后，熒光金標記RGC雖然在7d、14d和21d不斷減少，但是在同時間點RGC數(shù)量顯著多于WT組，視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示，trif/-視神經(jīng)束單位密度和寬度顯著高于WT組，阿米巴樣小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著少于WT組(P<0.01)。
　　 4.視網(wǎng)膜切片免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在WT假手術組小膠質(zhì)細胞定位于節(jié)細胞層(Ganglion cell layer，GCL)、內(nèi)核層(Inn

7、er nuclear layer，INL)和外核層(Outer nuclearlayer，ONL)，而視神經(jīng)受損7d和14d時，Ibal標記的小膠質(zhì)細胞更多地定位于GCL和內(nèi)網(wǎng)層(inner plexiform layer，IPL)，且形態(tài)呈少分枝凝集狀阿米巴樣。而trif/-組結(jié)果顯示，小膠質(zhì)細胞7d和14d時也呈現(xiàn)多分枝網(wǎng)狀，位于GCL、INL和IPL。
　　 5.離體實驗證明，Transwell共培養(yǎng)體系中，WT小膠質(zhì)細胞

8、受RGC損傷激活后，遷移至transwell膜一側(cè)的數(shù)量顯著多于trif/-組。
　　 6.離體小膠質(zhì)細胞Western blot結(jié)果表明，Transwell培養(yǎng)體系中，WT組小膠質(zhì)細胞和trif/-組小膠質(zhì)細胞TRIF下游信號分子表現(xiàn)出差異性：TRIF下游分子TBK1、IKKepsilon和NF-κB在WT12-36h呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，而trif/-組則呈現(xiàn)12h偏高，12h-36h逐漸降低或平穩(wěn)的趨勢。
　　 7.離

9、體小膠質(zhì)細胞Real-time RT-PCR結(jié)果和ELISA結(jié)果表明炎癥因子IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和iNOS在WT組12-36h呈逐漸上升趨勢，而在trif/-組則呈現(xiàn)下降或平穩(wěn)態(tài)勢，與WT組具有顯著差異。
　　 主要結(jié)論：
　　 1.利用在體動物視神經(jīng)鉗夾傷模型證實，視神經(jīng)損傷可引起RGC死亡，且fVEP傳導與損傷相關。
　　 2.WB結(jié)果證實，隨損傷時程增加，TRIF表達增加

10、。免疫熒光化學定位TRIF特異性表達于視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞，表明小膠質(zhì)細胞表達TRIF與視神經(jīng)損傷時程相關。
　　 3.熒光金標記RGC后進行視神經(jīng)鉗夾手術發(fā)現(xiàn)，標記的RGC隨損傷時間增加而逐漸減少，同時視網(wǎng)膜鋪片顯示神經(jīng)束形態(tài)顯著變化，表明視神經(jīng)鉗夾傷引發(fā)RGC死亡及其軸突崩解。WT和trif/-組動物的顯著性差異說明TRIF敲除后對RGC及其軸突具有一定保護作用，使損傷程度略有降低。
　　 4.對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞形態(tài)和數(shù)

11、量的描述結(jié)果表明，WT組小膠質(zhì)細胞較trif/-組更易表現(xiàn)出小膠質(zhì)細胞典型激活形態(tài)，其數(shù)量在損傷后明顯增加，且在視網(wǎng)膜中定位發(fā)生變化，說明TRIF敲除后小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)減弱。
　　 5.Transwell小膠質(zhì)細胞和RGC共培養(yǎng)體系結(jié)果表明，經(jīng)RGC體外軸突損傷刺激，WT小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出更顯著的遷移活性，而trif/-組遷移活性弱于WT組，進一步表明TRIF敲除后影響小膠質(zhì)細胞對RGC損傷的感知，減弱了小膠質(zhì)細胞的活化效應。<

12、br>　　 6.WB結(jié)果進一步表明，WT組小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)TRIF下游分子在RGC損傷后激活，而TRIF敲除則抑制了這一信號通路。
　　 7.Real-time RT-PCR結(jié)果和ELISA結(jié)果表明，WT組小膠質(zhì)細胞合成和分泌的炎癥因子顯著高于TRIF敲除組，表明TRIF敲除有效抑制了部分炎癥因子的合成和分泌，進一步說明TRIF敲除對RGC損傷具有保護作用。
　　 本研究初步闡明了RGC軸突損傷與小膠質(zhì)細胞炎癥反應的關系