辛伐他汀調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文分四個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活及替代激活的鑒定
　　目的：觀察BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活及替代激活后代謝分子的變化，判斷鑒別M1及M2型極化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法。
　　方法：小膠質(zhì)細(xì)胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分別單獨(dú)經(jīng)典激活及替代激活24小時(shí)，以ELISA方法檢測(cè)IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)iNOS、Arg-1、IL-

2、10、IL-12的mRNA表達(dá)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜MMr蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS經(jīng)典激活后呈M1型極化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表達(dá)量明顯升高，與生理對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05)。小膠質(zhì)細(xì)胞被IL-4替代激活后呈 M2極化，IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表達(dá)量顯著升高，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MMr蛋白熒光強(qiáng)度明顯上升，與生理對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)

3、差異（p<0.05)。
　　結(jié)論：小膠質(zhì)細(xì)胞被經(jīng)典激活呈M1型極化，替代激活呈M2型極化，不同極化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)炎性相關(guān)因子、精氨酸代謝分子及細(xì)胞膜特異性蛋白三個(gè)方面得到鑒別。
　　第二部分：Notch信號(hào)通路對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活途徑及替代激活途徑的調(diào)控
　　目的：研究Notch信號(hào)系統(tǒng)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活及替代激活的影響。
　　方法：1.小膠質(zhì)細(xì)胞以LPS及IL-4分別經(jīng)典激活及替代激活，以實(shí)時(shí)

4、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Notch信號(hào)通路分子Notch1、Jagged-1、Hes1、Hes5的表達(dá)。2.以DAPT阻斷Notch通道后再以LPS及IL-4分別刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，以ELISA方法檢測(cè)IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表達(dá)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜CD16/32及CD206蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1.小膠質(zhì)細(xì)胞生理對(duì)照組、LPS

5、誘導(dǎo)組及IL-4刺激組均表達(dá)Notch信號(hào)通路分子，LPS誘導(dǎo)組Notch信號(hào)通路分子Notch1、Jagged-1、Hes1表達(dá)增強(qiáng)。2.以DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后，小膠質(zhì)細(xì)胞IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表達(dá)量較單純LPS誘導(dǎo)組明顯降低（p<0.05)，IL-10分泌量及Arg-1mRNA表達(dá)量較單純IL-4誘導(dǎo)組提高（p<0.05)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膜蛋白CD16/32較單純LPS誘導(dǎo)組減

6、低，CD206較單純LPS誘導(dǎo)組增加。
　　結(jié)論：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在安靜狀態(tài)、經(jīng)典激活狀態(tài)及替代激活狀態(tài)均表達(dá)Notch信號(hào)分子，并且經(jīng)典激活狀態(tài)下Notch信號(hào)通道也被活化。Notch信號(hào)系統(tǒng)的激活使小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化增強(qiáng)，阻斷Notch信號(hào)通路后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活被抑制，M2型極化分子表達(dá)增強(qiáng)，表現(xiàn)出一定的M1型級(jí)化狀態(tài)向M2型轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。
　　第三部分：辛伐他汀對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Notc h信號(hào)通路的影響

7、r>　　目的：觀察辛伐他汀對(duì)于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響。
　　方法：部分小膠質(zhì)細(xì)胞以20ug/mL的辛伐他汀預(yù)處理后再給予100ng/ml的LPS刺激，部分細(xì)胞給予0.5μg/ml可溶性Jagged1/Fc嵌合蛋白及20ug/mL的辛伐他汀共同預(yù)處理后再給予100ng/ml的LPS刺激，以Western blot檢測(cè)Notch1、Hes1蛋白的表達(dá)，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) Notch1、Jagged-1、H

8、es1、Hes5 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：LPS誘導(dǎo)組Notch1、Jagged-1、Hes1、Hes5均較生理對(duì)照組顯著增加（p<0.05)，而辛伐他汀干預(yù)組Notch1、Hes1的蛋白測(cè)定及 Notch1、Hes1、Hes5mRNA表達(dá)均較單純LPS誘導(dǎo)組降低（p<0.05)，而Jagged-1無(wú)顯著改變。給予可溶性Jagged1/Fc嵌合蛋白后，Notch1及Hes1mRNA表達(dá)較辛伐他汀組上升。
　　結(jié)論：LPS

9、激活小膠質(zhì)細(xì)胞Notch信號(hào)通路，而辛伐他汀抑制Notch信號(hào)通路的活性，根據(jù)可溶性Jagged1/Fc嵌合蛋白對(duì)于辛伐他汀抑制作用的逆轉(zhuǎn)，判斷辛伐他汀對(duì)Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)可能發(fā)生在細(xì)胞外水平。
　　第四部分：辛伐他汀對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的調(diào)控
　　目的：研究辛伐他汀對(duì)于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的調(diào)控。
　　方法：小膠質(zhì)細(xì)胞給予20ug/ml及5ug/mL的高低濃度的辛伐他汀預(yù)處理，再分別給予LPS經(jīng)典激活及

10、可溶性Jagged1/Fc嵌合蛋白刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，以ELISA方法檢測(cè)IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表達(dá)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白CD206、CD16/32的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.辛伐他汀干預(yù)組IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表達(dá)量較LPS經(jīng)典激活組明顯降低，IL-10分泌量顯著升高（p<0.05)

11、，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD16/32蛋白陽(yáng)性表達(dá)量減少而CD206表達(dá)量增加。2.辛伐他汀干預(yù)組IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表達(dá)量較Ja gged1/Fc嵌合蛋白刺激組亦明顯降低，Arg-1及IL-10表達(dá)量顯著升高（p<0.05)。
　　結(jié)論：辛伐他汀抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活，同時(shí)也能抑制Notch信號(hào)激活劑Jagged1/Fc嵌合蛋白誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典激活，提示辛伐他汀通過(guò)介導(dǎo)Not