水稻谷蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因Gpa2的圖位克隆與功能分析.pdf

1、植物種子中儲存著大量的貯藏蛋白，可以在種子萌發(fā)時給幼苗提供營養(yǎng)物質(zhì)。谷蛋白是水稻種子中含量最高的貯藏蛋白，占種子中總蛋白的70％以上。谷蛋白首先在胚乳細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上以57kDa前體的形式合成，經(jīng)過復(fù)雜的囊泡運(yùn)輸過程，轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)貯藏液泡中。在那里谷蛋白前體在液泡加工酶的作用下水解成為40kDa酸性亞基和20kDa堿性亞基，最終聚集形成二型蛋白質(zhì)貯藏體。
　　谷蛋白前體增加突變體可以幫助我們闡明該蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到蛋白質(zhì)儲藏液泡的蛋白

2、質(zhì)運(yùn)輸途徑。本研究系統(tǒng)的研究了一個新的谷蛋白前體增加突變體-gpa2的突變機(jī)理，為進(jìn)一步全面闡明谷蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑奠定了基礎(chǔ)，主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)gpa2突變體是一個新的57kDa谷蛋白前體增加突變體，其種子中積累了大量的谷蛋白前體，淀粉和蛋白的積累量顯著降低，千粒重下降，胚乳中淀粉粒排列疏松，種子呈現(xiàn)出不透明的表型。
　　(2)我們研究發(fā)現(xiàn)水稻谷蛋白合成后會運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中并形成致密囊泡。大量的透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，野生

3、型中致密囊泡可以直接與蛋白貯藏液泡融合。gpa2突變體中致密囊泡的形成過程沒有受到影響，但致密囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生錯誤，谷蛋白被錯誤地分泌到胞外，造成二型蛋白質(zhì)貯藏體變小，谷蛋白在胞外空間內(nèi)大量聚集，與細(xì)胞壁類物質(zhì)一起形成了大量的PMB結(jié)構(gòu)，谷蛋白前體不能被有效剪切，從而在細(xì)胞中積累。
　　(3)圖位克隆及轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，Gpa2編碼一個全長為480個氨基酸的蛋白，含有VPS9結(jié)構(gòu)域，將該基因命名為OsVPS9a。gpa2在第三

4、個外顯子上發(fā)生了單堿基的顛換，導(dǎo)致翻譯提前終止。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，gpa2突變體中不合有OsVPS9a（包括截短的形態(tài)）蛋白，是一個功能喪失的突變體。OsVPS9a可以與水稻中的Rab5家族成員發(fā)生互作，是該小G蛋白家族的鳥嘌呤交換因子。在轉(zhuǎn)基因水稻根尖細(xì)胞中，OsVPS9a-GFP主要定位在MVB的膜上。
　　(4)vps9arab5a雙突變體中谷蛋白前體積累量比單突變體高，兩突變基因具有加性效應(yīng)。OsVPS9a與OsRA