高賴氨酸蛋白基因對水稻的遺傳轉化.pdf

1、水稻是主要的糧食作物，世界上約有1/2的人口以稻米為主食。但是在稻米、玉米等禾本科植物的儲藏蛋白中，賴氨酸含量偏低，是第一限制性氨基酸，嚴重影響其它氨基酸的吸收利用。提高稻米賴氨酸的含量，能在很大程度上提高稻米蛋白質的利用率。因此如何提高稻米的賴氨酸含量成了人們關注的問題。
　　 傳統(tǒng)的育種方法雖然在一定程度上提高了賴氨酸含量，但是提高潛力不大，費時費力?；蚬こ碳夹g的發(fā)展為改良水稻種子蛋白質營養(yǎng)品質提供了有效的手段，并取得一定

2、的研究進展。但是隨著轉基因植物的商品化生產(chǎn)，其安全性問題也日益引起人們的極大關注。選擇標記基因的使用是安全性問題的主要來源。
　　 本研究擬將具有自主知識產(chǎn)權的大豆高賴氨酸蛋白基因，賴氨酸重量比分別為18.22％和19.93％的GsHLP2和GsHLP8轉入水稻，對轉基因株系進行轉錄水平和賴氨酸含量分析，獲得轉高賴氨酸蛋白基因的水稻，為培育高賴氨酸轉基因水稻新品種提供材料。同時，本研究應用雙T-DNA載體，利用其后代重組分離性質

3、，可培育出無選擇標記基因的轉基因水稻，徹底解決篩選標記基因及其產(chǎn)物可能導致的轉基因安全性問題，試圖為培育高營養(yǎng)品質且生物安全的轉基因作物研究提供一條新的途徑。
　　 主要研究結果如下：
　　 1.克隆了水稻種子特異型啟動子GluB-4利用RT-PCR方法從水稻中克隆種子特異型啟動子GluB-4，序列分析表明，GluB-4基因序列與GenBank上公布的序列一致。
　　 2.構建了分別含高賴氨酸蛋白基因GsHLP2

4、和GsHLP8的雙T-DNA表達載體共8個構建分別由Ubi組成型啟動子和GluB-4水稻種子特異型啟動子調控的、分別帶有和不帶有增強子P2的、選擇標記基因為Bar基因的GsHLP2基因及GsHLP8基因的雙T-DNA植物表達載體8個，并將其導入到農(nóng)桿菌LBA4404，以用于下一步轉化水稻。
　　 3.獲得了轉高賴氨酸蛋白基因GsHLP8的水稻PCR陽性植株利用農(nóng)桿菌介導法對水稻“五優(yōu)稻1號”進行遺傳轉化，獲得轉pTTBUP2G8

5、抗性植株10株，轉pTTBGG8抗性植株20株，轉pTTBGP2G8抗性植株12株，PCR陽性植株分別為4株、14株、7株。
　　 4.檢測了轉基因水稻植株中高賴氨酸基因GsHLP8的轉錄水平對T0代轉pTTBUP2G8質粒PCR陽性植株進行了Real-timePCR檢測，結果表明，GsHLP8基因超量表達。
　　 5.轉基因水稻植株的賴氨酸含量測定對Real-TimePCR檢測超量表達的株系采用茚三酮顯色法進行賴氨酸含