細(xì)胞膜去極化調(diào)節(jié)細(xì)胞膜PIP-,2-水平及KCNQ2-Q3通道電流的研究.pdf

1、越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了細(xì)胞膜磷脂酰肌醇4，5二磷酸（PtdIns（4，5）P2，PIP2）在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞膜上的PIP2在諸如眾多的離子通道及離子轉(zhuǎn)運(yùn)體功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架、囊泡輸送、融合，及出胞和入胞等細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。細(xì)胞膜PIP2不僅是某些重要信號(hào)分子，如二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）的前體。PIP2本身作為信號(hào)分子發(fā)揮著自己的功能，它的水平被動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。細(xì)胞膜PIP2水平的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)機(jī)

2、制是磷脂酶C（PLC）介導(dǎo)的PIP2水解，這種事件依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制是眾多受體調(diào)節(jié)離子通道功能的重要機(jī)制。此外，在細(xì)胞中存在對(duì)穩(wěn)態(tài)PIP2水平調(diào)節(jié)的精細(xì)機(jī)制，主要通過(guò)多種肌醇磷脂酰肌酶和磷酸酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這項(xiàng)研究中，我們描述了一個(gè)細(xì)胞膜PIP2代謝調(diào)節(jié)的新機(jī)制。細(xì)胞膜電位去極化引起細(xì)胞膜PIP2水平增加，進(jìn)而增加表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中功能依賴PIP2的KCNQ2/Q3電流。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示細(xì)胞膜去極化引起的PIP2水平提高是通過(guò)激活蛋白

3、激酶C（PKC）進(jìn)而增加PI4-激酶（PI4 kinase）的活性引起的。
　　 一、細(xì)胞膜去極化對(duì)表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的KCNQ2/Q3通道電流的影響
　　 目的：在對(duì)KCNQ/M電流的研究過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞的KCNQ2/Q3的功能對(duì)膜電位的變化敏感，而這種反應(yīng)又有別于通道本身的電壓依賴性，本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行詳細(xì)描述，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法：將KCNQ和Kir通道的質(zhì)粒線性化，體

4、外轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cRNA，注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞，表達(dá)為相應(yīng)通道，用雙電極電壓鉗記錄的方法，觀察細(xì)胞膜去極化及細(xì)胞外液鉀離子濃度的改變對(duì)KCNQ電流的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)果：（1）長(zhǎng)時(shí)間膜電位去極化（-40 mV～+40 mV），可觀察到表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的KCNQ2/Q3電流呈時(shí)間依賴性及電壓依賴性增加。當(dāng)膜電壓再極化回到靜息電位水平時(shí)，KCNQ2/Q3電流恢復(fù)到原水平，這說(shuō)明去極化引起的KCNQ2/Q3電流增加具有可逆性特征。

5、用M/KCNQ通道特異阻斷劑linopirdine（30μM）可完全阻斷初始電流和增加的電流，這說(shuō)明增加的電流是KCNQ2/Q3電流，而不是其它的電流成分。（2）通過(guò)測(cè)定電壓鉗制（0 mV，15 min）前后， KCNQ2/Q3電流在0 mV激活及-60 mV去活的時(shí)程，觀察到膜電位去極化不改變KCNQ2/Q3電流動(dòng)力學(xué)時(shí)程。通過(guò)測(cè)定膜電位去極化（0 mV，15 min）前后KCNQ2/Q3電流的電導(dǎo)-電壓關(guān)系曲線，可觀察到膜電位去極化

6、不改變KCNQ2/Q3電流激活特點(diǎn)。（3）在卵母細(xì)胞上分別表達(dá)不同亞型的KCNQ通道，觀察膜電位去極化（0 mV，15 min）對(duì)其電流幅度及電流特征的影響，發(fā)現(xiàn)去極化對(duì)KCNQ電流的調(diào)節(jié)具有亞型特異性。去極化可增大KCNQ2和KCNQ2/Q3電流，但不影響KCNQ1和KCNQ1/KCNE1電流。去極化對(duì)KCNQ2作用的電壓依賴性特點(diǎn)與對(duì)KCNQ2/Q3影響的特點(diǎn)相同，二者半最大增大電壓無(wú)明顯差異。同樣，去極化不改變KCNQ2通道電流的

7、激活特征。（4）在卵母細(xì)胞上分別表達(dá)Kir2.1和Kir2.3通道，觀察膜電位去極化（+40mV）對(duì)二者電流的影響，發(fā)現(xiàn)去極化可不同程度地增大Kir電流，去極化增大Kir2.3電流的程度大于Kir2.1。我們以前的研究顯示Kir2.1對(duì)PIP2親和力較Kir2.3大，提示去極化可能通過(guò)影響PIP2水平調(diào)節(jié)通道功能。（5）觀察了細(xì)胞外鉀離子濃度對(duì)KCNQ2/Q3電流的影響，目的是為了檢測(cè)去極化引起的KCNQ2/Q3電流增大是否是因?yàn)殁涬x子

8、大量外流引起的細(xì)胞外鉀濃度升高所致。發(fā)現(xiàn)提高細(xì)胞外液鉀離子濃度（10 mM）不影響去極化對(duì)KCNQ2/Q3電流的作用。（6）使用高鉀外液（ND96K：含96 mMK+）使膜電位去極化，來(lái)模擬電壓鉗制的效果，觀察其是否也可以引起KCNQ2/Q3電流增大。發(fā)現(xiàn)ND96K孵育（15 min）引起的電流增加幅度與ND96下電壓鉗制在0 mV（15 min）無(wú)明顯差異。高鉀同樣不影響KCNQ2通道的電流動(dòng)力學(xué)和激活特征。這些結(jié)果證明去極化本身可以

9、使KCNQ2/Q2電流增加。
　　 結(jié)論：（1）膜電位去極化可增大表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的KCNQ2/Q3通道電流。這種增大作用具有時(shí)間依賴性及電壓依賴性的特征。（2）膜電位去極化沒(méi)有影響KCNQ2/Q3通道電流動(dòng)力學(xué)時(shí)程及電導(dǎo)-電壓關(guān)系曲線。（3）膜電位去極化對(duì)KCNQ電流的調(diào)節(jié)具有亞型特異性。（4）膜電位去極化可不同程度增大Kir亞型通道電流。提示去極化可能通過(guò)影響PIP2水平調(diào)節(jié)通道功能。（5）提高細(xì)胞外液鉀離子濃度（1

10、0 mM）不能取消或降低去極化鉗制引起的KCNQ2/3電流增大的現(xiàn)象，表明去極化引起的電流增大與細(xì)胞外鉀濃度的增加無(wú)關(guān)，即：KCNQ2/3電流增大由膜電位去極化本身引起。（6）細(xì)胞外高鉀使膜電位去極化并可模擬電壓鉗制引起的KCNQ2/Q3電流增大，同樣不影響通道的激活特性。這進(jìn)一步證明了膜電位去極化本身可增大KCNQ2/Q3電流。
　　 二、細(xì)胞膜去極化提高細(xì)胞膜PIP2水平進(jìn)而增大KCNQ2/3通道電流的分子學(xué)機(jī)制
　　

11、 目的：上部分實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞膜去極化可能通過(guò)提高細(xì)胞膜PIP2水平，進(jìn)而增大了表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的KCNQ2/Q3。這部分我們主要研究其分子學(xué)機(jī)制。
　　 方法：（1）將KCNQ2/Q3通道和Ci-VSP共表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞，用雙電極電壓鉗記錄的方法，觀察Ci-VSP和去極化對(duì)KCNQ2/Q3電流的調(diào)節(jié)，探討去極化過(guò)程對(duì)PIP2水平的影響。通過(guò)使用高滲溶液預(yù)提高膜PIP2含量，觀察膜電位去極化對(duì)PIP2水平的影響。（2）

12、通過(guò)使用PI4-激酶的拮抗劑阻斷PIP2的合成，觀察PI4-激酶是否介導(dǎo)了膜電位去極化引起PIP2水平提高的過(guò)程。（3）通過(guò)使用PKC的激動(dòng)劑和拮抗劑，觀察PKC是否介導(dǎo)了膜電位去極化引起PIP2水平提高的過(guò)程。（4）通過(guò)薄層色譜的方法直接測(cè)定PIP2含量的變化，觀察膜電位去極化和激活PKC對(duì)細(xì)胞膜PIP2水平的影響。（5）通過(guò)使用PKA的拮抗劑，觀察PKA是否介導(dǎo)了膜電位去極化引起PIP2水平提高的過(guò)程。（6）用膜片鉗記錄的方法，觀察

13、去極化對(duì)DRG神經(jīng)元中內(nèi)源性表達(dá)的M電流和CHO細(xì)胞中異源性表達(dá)的KCNQ2/Q3電流的作用。
　　 結(jié)果：（1）通過(guò)共表達(dá)Ci-VSP，推測(cè)去極化可激活：PIP2合成。通過(guò)薄層色譜的方法證明了膜電位去極化可引起PIP2和PIP水平升高。（2）高滲溶液可通過(guò)激活β型PIP5-激酶而提高PIP2水平。所以如果去極化引起的電流增加依賴PIP2的合成增加，那么用高滲溶液預(yù)孵育應(yīng)可減弱去極化增大KCNQ2/Q3電流的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高

14、滲溶液可減弱去極化引起的電流增加。（3）采用wortmannin阻斷PI4-激酶，可基本取消去極化引起的KCNQ2/Q3電流增大作用。（4）PKC的激動(dòng)劑PMA同樣可增大KCNQ2/Q3電流而對(duì)KCNQ1無(wú)作用。PMA引起的電流增大的時(shí)程與去極化引起電流增大的時(shí)程相似，且其作用可被去極化的作用所阻斷。PKC的阻斷劑Bis可取消去極化引起的電流增大作用。但是PMA增大電流的同時(shí)，引起KCNQ2/Q3通道的電導(dǎo)-電壓關(guān)系曲線右移，而對(duì)KCN

15、Q1無(wú)作用。薄層色譜的方法證明了用PMA激活PKC同樣可以提高卵母細(xì)胞PIP2和PIP的水平。
　　 （5）結(jié)果顯示：PKA的抑制劑H-89不能阻斷去極化引起的KCNQ2/Q3電流增大。提示PKA不是去極化引起的KCNQ2/Q3電流增大的分子學(xué)機(jī)制（6）去極化（-20 mV）不能增大DRG神經(jīng)元中內(nèi)源性表達(dá)的M電流及CHO細(xì)胞中異源性表達(dá)的KCNQ2/KCNQ3電流。PMA（100 nM）可抑制CHO細(xì)胞中異源性表達(dá)的KCNQ2

16、/KCNQ3電流，而不是激活作用。更大程度的去極化（+20 mV）可逆性抑制DRG神經(jīng)元中內(nèi)源性表達(dá)的M電流。
　　 結(jié)論：（1）膜電位去極化引起KCNQ2/Q3增大是通過(guò)提高PIP2水平實(shí)現(xiàn)。（2）高滲溶液預(yù)孵育減弱了去極化增大KCNQ2/Q3電流的作用。（3）去極化引起的PIP2水平升高是由于激活了PI4-激酶。（4）PKC的激活介導(dǎo)了去極化引起的KCNQ2/Q3電流增大。（5）PKA不是去極化引起的KCNQ2/Q3電流增大