DDRGK1與端粒酶催化亞基hTERT相互作用的研究.pdf

1、過去幾十年端粒生物學(xué)研究成果顯示端粒長度和端粒酶活性與細(xì)胞的壽命以及人類疾病密切相關(guān).端粒酶是端粒重要的結(jié)合蛋白之一，以端粒依賴或不依賴方式在細(xì)胞衰老及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。人類端粒酶活性與其逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的表達(dá)高度相關(guān)，hTERT的表達(dá)調(diào)控對端粒酶活性的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用.然而，hTERT的調(diào)控機(jī)理和生物學(xué)功能尚不完全明確。人類端粒酶是一

2、個分子量高達(dá)2MD的蛋白復(fù)合物，但被鑒定的hTERT結(jié)合蛋白總分子量遠(yuǎn)小于2MD，說明大部分端粒酶組分尚未發(fā)現(xiàn).因此，新的hTERT結(jié)合蛋白的篩選和鑒定是研究其端粒酶活性和生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)，對于闡明端粒酶在癌癥和衰老相關(guān)疾病等發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)理具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究以hTERT氨基酸序列中一段進(jìn)化保守的端粒酶特有基序 T-motif（547-594aa）為“bait”，構(gòu)建hTERT T-motif的酵母雙雜交系統(tǒng)

3、，篩選和鑒定hTERT新的結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)DDRGK家族蛋白DDRGK1（DDRGK domain-containing protein1）與hTERT可以相互作用.在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，外源表達(dá)hTERT和DDRGK1，進(jìn)行正反免疫共沉淀實驗，進(jìn)一步證實DDRGK1和hTERT可以相互結(jié)合；構(gòu)建Flag標(biāo)簽的hTERT和DDRGK1不同突變體，通過免疫共沉淀實驗，進(jìn)行DDRGK1和hTERT的蛋白互作區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)hTERT的第5

4、67-594氨基酸殘基區(qū)域是與DDRGK1相互作用所必需的。為鑒定DDRGK1是否調(diào)控hTERT端粒酶活性，進(jìn)行TRAP（Telomeric reapeat amplification protocol）實驗，發(fā)現(xiàn)在 MCF-7和HeLa細(xì)胞中過表達(dá) DDRGK1顯著抑制hTERT端粒酶活性；相反，基因沉默DDRGK1能夠促進(jìn)端粒酶活性.端粒酶活性和hTERT的表達(dá)高度相關(guān)，因此，hTERT的表達(dá)調(diào)控對端粒酶活性的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用，主要

5、包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控.我們通過實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,Q-PCR）和免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)或基因沉默DDRGK1對hTERT信使RNA(mRNA)水平?jīng)]有明顯改變.而過表達(dá)DDRGK1后hTERT蛋白水平顯著下降，基因沉默DDRGK1后hTERT蛋白水平顯著上升.DDRGK1很可能通過影響hTERT蛋白穩(wěn)定性來調(diào)控端粒酶活性。研究報導(dǎo)DDRGK1在類泛素化修飾