乙酰羥酸合成酶亞基間相互作用的研究.pdf

1、我國(guó)是一個(gè)人口多、耕地少的農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)業(yè)的增長(zhǎng)和可持續(xù)發(fā)展是我國(guó)經(jīng)濟(jì)繁榮與社會(huì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。農(nóng)藥的使用極大地改善了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但也面臨農(nóng)藥過(guò)度使用或單一機(jī)制長(zhǎng)期大面積使用而產(chǎn)生的抗性問(wèn)題。如何充分利用已經(jīng)被實(shí)踐證明了的超高效除草劑靶標(biāo)酶，發(fā)展新型綠色農(nóng)藥，解決除草劑抗性問(wèn)題，已經(jīng)成為全球關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。
　　乙酰羥酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)是幾類商品化超高效除草劑的作用靶標(biāo)，是催化支鏈氨基

2、酸生物合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵性酶。所有的AHAS都是由催化亞基和調(diào)控亞基組成的，催化亞基和調(diào)控亞基的相互作用對(duì)酶行使全部機(jī)制非常重要。我們的研究成果及相關(guān)文獻(xiàn)表明:AHAS調(diào)控亞基激活功能的缺失對(duì)AHAS活性的影響程度與除草劑所起的作用相當(dāng)。并且AHAS亞基間異源重組激活現(xiàn)象說(shuō)明AHAS亞基間相互作用具有共同的作用界面。這個(gè)共同作用界面是潛在的抑制劑靶位，通過(guò)模擬相互作用的肽段以及設(shè)計(jì)靶向相互作用的小分子，可以發(fā)展新作用機(jī)制的農(nóng)藥活性先

3、導(dǎo)化合物。
　　迄今為止，AHAS復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)還沒(méi)有被報(bào)道，分子水平上的亞基間相互作用的報(bào)道也很少，對(duì)于AHAS的催化反應(yīng)機(jī)制、調(diào)控亞基對(duì)催化亞基的激活機(jī)制以及支鏈氨基酸對(duì)全酶活性的反饋調(diào)控機(jī)制更是知之甚少。因此，AHAS亞基間相互作用的研究對(duì)開(kāi)發(fā)新型的農(nóng)藥活性先導(dǎo)化合物具有重要的意義。本論文主要進(jìn)行了以下幾方面的工作:
　　一、首次建立了蛋白表面掃描標(biāo)記技術(shù)(a global-surface，site-directed

4、 labelingscanning method)用于快速鑒定蛋白-蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，并與定點(diǎn)突變技術(shù)以及計(jì)算機(jī)方法相結(jié)合提出了一套完整的研究分子水平蛋白-蛋白相互作用的方法。該方法可以廣泛的用于研究其他具有相互作用的蛋白。
　　二、通過(guò)以上方法對(duì)AHAS亞基間相互作用進(jìn)行了研究，并確定了調(diào)控亞基(ilvH)的Arg26和Asp69是與催化亞基(ilvI)相互作用的關(guān)鍵殘基。生物活性數(shù)據(jù)與pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致證明:

5、ilvH的Arg26和Asp69是與ilvI相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基;Arg26和Asp69側(cè)鏈的電性對(duì)相互作用很重要;并且Arg26和Asp69與ilvI的作用是相互協(xié)同的。依次以亞基相互作用的關(guān)鍵區(qū)域和關(guān)鍵殘基為條件篩選HEX對(duì)接得到的AHAS全酶復(fù)合物構(gòu)象，確定了最接近自然狀態(tài)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。依據(jù)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息對(duì)AHAS的激活和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　三、催化亞基(ilvI)的六個(gè)半胱氨酸全部突變?yōu)楸彼岬玫降膇lv

6、I'的活性與ilvI相似，可以用ilvI'來(lái)代替ilvI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)蛋白表面掃描標(biāo)記的方法初步確定催化亞基Ter308周圍可能是與調(diào)控亞基相互作用的區(qū)域。催化亞基二聚體界面殘基的突變研究發(fā)現(xiàn):催化亞基的聚集狀態(tài)對(duì)酶催化活性以及與調(diào)控亞基的相互作用有很大的影響。
　　四、AHAS亞基間的相互作用受反應(yīng)體系的影響，反應(yīng)緩沖液pH值對(duì)相互作用的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，極性的環(huán)境有利于亞基間的相互作用，暗示了在AHAS亞基相互作用的界面上可能

7、有較多的極性殘基。AHAS的催化反應(yīng)需要金屬離子作為輔酶，但是其對(duì)金屬離子的特異性并不高。同一主族的二價(jià)金屬離子Mg2+、Ca2+、Sr2+和Ba2+，都可以使大腸桿菌AHASⅢ行使催化功能，但是隨著金屬離子半徑的增加，單獨(dú)催化亞基和重組酶的活性都在降低，但是調(diào)控亞基對(duì)催化亞基的激活倍數(shù)卻在增加。
　　五、激活大腸桿菌AHASⅢ催化亞基(ilvI)的最小調(diào)控亞基(ilvH)的肽段被確定是△N14-△C89，它構(gòu)成一個(gè)完整的ACT結(jié)

8、構(gòu)域，但是不具有反饋調(diào)控活性，暗示了調(diào)控亞基對(duì)催化亞基的激活和反饋調(diào)控進(jìn)行的相互作用是存在差異的。酶活性數(shù)據(jù)與微量熱泳動(dòng)(MST)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:△N14-△C89不僅可以激活和結(jié)合同源的催化亞基ilvI和同種屬異源的ilvB（大腸桿菌AHASⅠ的催化亞基），還可以跨種屬激活和結(jié)合酵母、擬南芥以及煙草AHAS的催化亞基。而且AN14-AC89的氨基酸序列在AHAS調(diào)控亞基中具有高度的序列相似性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在所有的AHAS中存在共同的

9、亞基間相互作用的界面。這為靶向亞基間相互作用開(kāi)發(fā)AHAS抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。
　　六、AHAS調(diào)控亞基中包含典型的ACT結(jié)構(gòu)域，如同其他的ACT結(jié)構(gòu)域，與效應(yīng)子（支鏈氨基酸）結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)AHAS催化活性的調(diào)控。支鏈氨基酸對(duì)AHAS全酶活性的抑制可以達(dá)到80％左右，與磺酰脲類和咪唑啉酮類除草劑的抑制效率相當(dāng)。通過(guò)對(duì)二十種編碼氨基酸抑制活性的篩選，確定支鏈氨基酸的抑制能力最強(qiáng)。希望在計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接的指導(dǎo)下對(duì)支鏈氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得

10、模仿支鏈氨基酸反饋抑制機(jī)制的新型的農(nóng)藥活性先導(dǎo)化合物。在生物進(jìn)化過(guò)程中，ACT結(jié)構(gòu)域作為一個(gè)進(jìn)化模塊，廣泛的分布于各種生物體內(nèi)，出現(xiàn)在各種不同的蛋白中。ACT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的平均相似性只有16％，但是目前已有的ACT結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)卻高度相似（RMSD約為2.5(A)）。AHAS的最小激活肽段構(gòu)成一個(gè)完整的ACT結(jié)構(gòu)域，它的跨種屬激活能力引發(fā)了我們對(duì)ACT結(jié)構(gòu)域調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在的思考。大腸桿菌AHASⅡ的調(diào)控亞基(ilvM)與其它AHA

11、S調(diào)控亞基的氨基酸序列相似性很低(13-22％)，但是ilvM可以使大腸桿菌、酵母、煙草以及擬南芥AHAS催化亞基的活性增加8-16倍，這更堅(jiān)定了我們對(duì)ACT結(jié)構(gòu)域調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在的想法。我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了三種ACT結(jié)構(gòu)域蛋白，活性數(shù)據(jù)結(jié)果顯示:不同的ACT結(jié)構(gòu)域蛋白可以使AHAS的催化亞基活性增加1-2倍，激活所需ACT結(jié)構(gòu)域蛋白的量因AHAS催化亞基的種屬不同而存在差異。初步證實(shí)了ACT結(jié)構(gòu)域跨途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在的可能性。
　　綜上所述

12、，本文首次提出了可快速鑒定蛋白-蛋白相互作用關(guān)鍵區(qū)域以及殘基的蛋白表面掃描標(biāo)記技術(shù)，與定點(diǎn)突變技術(shù)以及計(jì)算方法相結(jié)合構(gòu)建了一套完整的研究分子水平蛋白相互作用的方法，該方法可以廣泛的用于研究其他具有相互作用的蛋白。本文中通過(guò)該方法確定了大腸桿菌AHASⅢ亞基間相互作用的界面以及關(guān)鍵氨基酸殘基，建立了AHAS催化亞基與調(diào)控亞基相互作用的分子模型。并且對(duì)AHAS的催化、激活以及反饋調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。研究了反應(yīng)體系對(duì)AHAS亞基間相互作

13、用的影響。確定了激活A(yù)HAS催化亞基的最小調(diào)控亞基肽段，這個(gè)最小激活肽段，構(gòu)成完整的ACT結(jié)構(gòu)域，具備跨種屬異源激活A(yù)HAS催化亞基的能力，而且其氨基酸序列在AHAS調(diào)控亞基中具有很高的相似性，說(shuō)明所有的AHAS中存在共同的亞基間相互作用的界面。這為靶向亞基間相互作用開(kāi)發(fā)新作用機(jī)制的農(nóng)藥活性先導(dǎo)化合物提供了理論基礎(chǔ)。支鏈氨基酸對(duì)AHAS催化活性的抑制程度與商品化的除草劑相當(dāng)，模仿支鏈氨基酸的反饋調(diào)控，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)新型作用機(jī)制的農(nóng)藥活性先